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Edit-R HDR plasmid donor kits

プラスミドDNA EGFP、mKate2、またはカスタムシーケンスHDRノックインドナーのアッセンブリ用キット

キットには、CRISPR-Cas9とHDR経路を使用して任意のゲノム位置にEGFPまたはmKate2蛍光レポーターまたはカスタムインサート配列を導入するためのカスタムプラスミドDNAドナーを構築するために必要なコンポーネントが含まれています。

特長

CRISPR-Cas9を使用した遺伝子工学では、切断された標的DNAの修復を、非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え修復(HDR)の2つのいずれかの経路で行います。特定の変異を生成したり、目的の配列を挿入または削除したりするためのDNAの正確な修復には、HDR経路が必要です。このプロセスは、DNAの二本鎖切断修復に使用できるDNAドナーテンプレートが利用できるかどうかに依存します。最も一般的なアプリケーションの1つは、遺伝子の一端への蛍光レポーター配列の挿入です。 Edit-R HDRプラスミドドナーキットを使用すると、EGPFまたはmKate2蛍光レポーターまたはユーザー独自のカスタムシーケンスをほぼすべてのゲノム位置に挿入するためのプラスミドドナーを迅速かつ簡単に作製できます。

Highlights

  • DNAドナープラスミドを迅速かつ効率的に組み立てます。
  • ドナープラスミドの設計、組み立て、確認のための検証済みプロトコールが提供されます。
  • CRISPR Design Tool を利用して、切断部位へのcrRNAを設計できます。
  • 挿入部位に隣接する5 ‘および3’相同性アームを作成するためのプライマー設計用のHDR Donor Designerとシームレスに統合されています。

 

HDRプラスミドドナーキットには、カスタムDNAドナーテンプレートプラスミドを構築および品質チェックするためのすべてのDNAコンポーネントが含まれており、Edit-R HDR DNAドナープラスミドホモロジーアームカスタムプライマーペアと組み合わせると、ほぼすべてのゲノム位置に蛍光レポーターを導入できます。

HDR Donor Designerは、プラスミドの組み立てに必要な5’および3’相同性アームの増幅用PCRプライマーを設計および注文するために使用されます。

キット構成と容量
Cat # Description Item# Amount
UK-008100-01-10 Edit-R HDR Plasmid Donor Kit – EGFP
Edit-R HDR Plasmid Donor Backbone U-008300-01-1200 1200 ng
Edit-R HDR insert – EGFP U-008100-01-250 250 ng
Edit-R Colony PCR Primer EGFP Forward U-008100-FB-05 5 nmol
Edit-R Colony PCR Primer EGFP Reverse U-008100-RA-05 5 nmol
Edit-R Colony PCR Primer Backbone Forward U-008300-FW-05 5 nmol
Edit-R Colony PCR Primer Backbone Reverse U-008300-RV-05 5 nmol
UK-008200-03-10 Edit-R HDR Plasmid Donor Kit -mKate2
Edit-R HDR Plasmid Donor Backbone U-008300-01-1200 1200 ng
Edit-R HDR insert – mKate2 U-008200-01-250 250 ng
Edit-R Colony PCR Primer mKate2 Forward B U-008200-FB-05 5 nmol
Edit-R Colony PCR Primer mKate2 Reverse A U-008200-RA-05 5 nmol
Edit-R Colony PCR Primer Backbone Forward U-008300-FW-05 5 nmol
Edit-R Colony PCR Primer Backbone Reverse U-008300-RV-05 5 nmol
UK-008300-01-10 Edit-R HDR Plasmid Donor Kit – Universal
Edit-R HDR Plasmid Donor Backbone U-008300-01-1200 1200 ng
Edit-R Colony PCR Primer Backbone Forward U-008300-FW-05 5 nmol
Edit-R Colony PCR Primer Backbone Reverse U-008300-RV-05 5 nmol

サポートデータ

U2OS細胞におけるEGFPでN末端にタグ付けされたLMNA

U2OS細胞に、DharmaFECT Duoを用いて、Cas9 mRNA、LMNAをターゲットとする化学合成crRNA:tracrRNA、および相同性アームあたり約1000 bpの相同性を含むLMNAのN末端に特異的なEGFPドナープラスミドをトランスフェクトしました。必要に応じて細胞を継代し、トランスフェクションの7日後にInCell 2200ハイコンテント蛍光顕微鏡で画像化しました。

U2OS細胞におけるmKate2-SEC61B融合

小胞体におけるタンパク質輸送の構成要素であるSEC61B遺伝子へのmKate2 N末端融合の作製。U2OS細胞に50 nM SEC61B-crRNA:tracrRNA、25 nM Cas9タンパク質、2 ng/µL SEC61B mKate2 HDRドナープラスミド、0.3 µL/well DharmaFECT Duoをトランスフェクトし、トランスフェクションの7日後に蛍光顕微鏡で可視化しました。Note: Cas9タンパク質トランスフェクションのリボ核タンパク質(RNP)複合体比は2:1です。

マルチプレックスCRISPR-Cas9を介したノックインによって作製されたEGFP-LMNAおよびmKate2-SEC61B蛍光レポーターを備えたU2OS細胞株

LMNAおよびSEC61Bをターゲットとする化学合成crRNAは、CRISPR Design Toolを使用して各タンパク質のN末端近くに二本鎖切断されるように設計されました。Edit-R HDR Donor Designerを使用して、LMNAおよびmKate2のN末端にそれぞれ特異的なEGFPおよびmKate2ドナープラスミドを生成する試薬を設計しました。両方のドナープラスミドは、相同性アームあたり約1000塩基対の相同性を含んでいます。U2OS細胞は、トランスフェクションの前日に96ウェルプレートにウェルあたり10,000細胞で播種しました。予備実験で決定された至適条件に従って、0.3 µL /ウェルのDharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用して細胞をトランスフェクトしました。次の試薬を同時に細胞にトランスフェクトしました:200 ngのEdit-R™ Cas9 Nuclease mRNA、25 nMのLMNAを標的とする化学合成crRNA:tracrRNA、25 nMのSEC61Bを標的とする化学合成crRNA:tracrRNA、200 ngのEGFP-LMNAドナープラスミド、および200ng mKate2-SEC61Bドナープラスミド。細胞を3回継代し、トランスフェクションの7日後にNikon倒立落射蛍光顕微鏡で画像化し、EGFP(緑)とmKate2(赤)の両方が挿入された単一細胞を特定しました。

U2OS細胞においてN末端がEGFPでタグ付けされたLMNAとN末端がmKate2でタグ付けされたSEC61B

U2OS細胞に、DharmaFECT Duoを用いて、Cas9 mRNA、LMNAを標的とする化学合成crRNA-tracrRNA、SEC61Bを標的とする化学合成crRNA:tracrRNA、相同性アームあたり約1000 bpの相同性を含むLMNAのN末端に特異的なEGFPドナープラスミド、および相同性アームあたり約1000 bpの相同性を含むSEC61BのN末端に特異的なmKate2ドナープラスミドをトランスフェクトしました。必要に応じて細胞を継代し、トランスフェクションの7日後にInCell 2200ハイコンテント蛍光顕微鏡で画像化して、EGFPとmKate2の両方が挿入された単一細胞を特定しました。

Dharmacon Edit-R mKate2ノックインドナー

Edit-R mKate2プラスミドドナーマップと重要なベクター機能。この図では、例として500 bpの相同性アームが含まれています。

プラスミドドナークローニングワークフローの図

コンポーネントの順序付け、相同性アームの増幅、およびプラスミドドナーの生成を含むプラスミドドナーのクローニングワークフローの図。図の色は、DNAの由来を示しています(濃い青 = 5′ 相同性アーム、水色 = 3′ 相同性アーム、赤 = mKate2蛍光レポーター配列、オレンジ = プラスミドバックボーン)。medium alone = 培地のみのネガティブPCRコントロール

コロニーPCRによる成功したクローニングの検出

ユニバーサルバックボーン、EGFPインサート、および2つのPCRで生成された相同性アームを備えたEdit-Rドナープラスミドキットのギブソンクローニング結果。得られたクローニング反応をNEB 5-α化学コンピテントセルで形質転換し、37℃で一晩増殖させました。10個の細菌コロニーをランダムに選択し、コロニーPCRを実行して、各相同性アーム(L = 5′ 相同性アームおよびR = 3′ 相同性アーム)の存在を検出しました。コロニーPCRアンプリコンは、エチジウムブロマイドとFastRuler低分子量分子量マーカーを含む2%アガロースE-ゲルで実施しました。

mKate2ノックインクローン細胞株を作製するためのワークフロー

mKate2ノックインクローン細胞株を作製するために必要な主要なプロセスステップと一般的なタイミングを示すワークフロー

関連リンク

【本社サイト】Edit-R HDR Plasmid Donor Kits

CRISPR Design Tool

Edit-R HDR Donor Designer