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Edit-R HDR plasmid donor components

HDRプラスミド構築のためのインサートとバックボーン

Edit-R HDRドナープラスミドを構築するためのプラスミドバックボーンおよび蛍光インサートDNAフラグメントのみをご提供しています。

特長

HDR経路を使用してEGFPまたはmKate2を挿入するためのEdit-R HDR Plasmid Donor Kitは、ユニバーサルプラスミドバックボーン、DNAインサート、および2つのカスタム相同性アームから構成されています。任意のDNAを挿入するためのプラスミドドナーの組み立ては、インサート配列をユーザー提供のDNAフラグメントに置き換える以外は、同じ戦略を利用します。Edit-R HDR plasmid donor componentsには、EGFPまたはmKate2インサートとプラスミドバックボーンのみが含まれます。

ドナープラスミドの使用と組み立てには、挿入部位に隣接する5’および3′ 相同性アームの増幅のための2つのプライマーペアの設計が必要です。これらのプライマーは、HDR Donor Designerを使用して設計およびご注文いただけます。

Highlights

  • DNAドナープラスミドを迅速かつ効率的に組み立てます。
  • ドナープラスミドの設計、組み立て、確認のための検証済みプロトコールが提供されます。
  • CRISPR Design Toolを利用して、切断部位へのcrRNAを設計できます。
  • 挿入部位に隣接する5 ‘および3’相同性アームを作成するためのプライマー設計用のHDR Donor Designerとシームレスに統合されています。
構成と容量
Catalog Number Description Item Number Quantity
UK-008100-02-10 Edit-R HDR Plasmid Donor & Insert – EGFP
Edit-R HDR Plasmid Donor Backbone U-008300-01-1200 1200 ng
Edit-R HDR insert – EGFP U-008100-01-250 250 ng
UK-008200-04-10 Edit-RHDR Plasmid Donor & Insert -mKate2
Edit-RHDR Plasmid Donor Backbone U-008300-01-1200 1200 ng
Edit-RHDR Insert – mKate2 U-008200-01-250 250 ng
U-008300-01-1200 Edit-R HDR Plasmid Donor Backbone U-008300-01-1200 1200 ng

Note:バックボーンとEGFPまたはmKate2インサートは、HDR Plasmid Donor Kitに含まれています。バックボーンとEGFPまたはmKate2インサートのみをより多く必要な場合には、本Edit-R HDR plasmid donor componentsを注文してください。

サポートデータ

U2OS細胞におけるEGFPでN末端にタグ付けされたLMNA

U2OS細胞に、DharmaFECT Duoを用いて、Cas9 mRNA、LMNAをターゲットとする化学合成crRNA:tracrRNA、および相同性アームあたり約1000 bpの相同性を含むLMNAのN末端に特異的なEGFPドナープラスミドをトランスフェクトしました。必要に応じて細胞を継代し、トランスフェクションの7日後にInCell 2200ハイコンテント蛍光顕微鏡で画像化しました。

U2OS細胞におけるmKate2-SEC61B融合

小胞体におけるタンパク質輸送の構成要素であるSEC61B遺伝子へのmKate2 N末端融合の作製。U2OS細胞に50 nM SEC61B-crRNA:tracrRNA、25 nM Cas9タンパク質、2 ng /μLSEC61BmKate2HDRドナープラスミド、0.3 μL/ウェルDharmaFECT Duoをトランスフェクトし、トランスフェクションの7日後に蛍光顕微鏡で可視化しました。Note: Cas9タンパク質トランスフェクションのリボ核タンパク質(RNP)複合体比は2:1です。

HDRプラスミドドナーのクローニングに必要な材料

Edit-R HDRプラスミドドナーは、蛍光タンパク質挿入配列、カットベクターバックボーン、挿入部位に隣接するゲノム領域に対して設計したカスタムPCRプライマーで生成された2つの相同性アームの組み立てによって作製されます。

Dharmacon Edit-R mKate2 knock-in donor

Edit-R mKate2プラスミドドナーマップと重要なベクター機能。この図では、例として500 bpの相同性アームが含まれています。

プラスミドドナークローニングワークフローの図

コンポーネントの順序付け、相同性アームの増幅、およびプラスミドドナーの生成を含むプラスミドドナーのクローニングワークフローの図。図の色は、DNAの由来を示しています(濃い青 = 5′ 相同性アーム、水色 = 3′ 相同性アーム、赤 = mKate2蛍光レポーター配列、オレンジ=プラスミドバックボーン)。medium alone = 培地のみのネガティブPCRコントロール

mKate2ノックインクローン細胞株を作製するためのワークフロー

Kate2ノックインクローン細胞株を作製するために必要な主要なプロセスステップと一般的なタイミングを示すワークフロー

関連リンク

【本社サイト】Edit-R HDR plasmid donor components

CRISPR Design Tool

Edit-R HDR Donor Designer