デザイン済みSynthetic sgRNA (化学合成sgRNA)

効率的な遺伝子ノックアウトと高い特異性を提供する化学合成シングルガイドRNA

• 目的のターゲット遺伝子の編集（DNA切断）が保証されています。
• タンパク質の機能的ノックアウトの可能性をアルゴリズムで最大化し、オフターゲット編集を最小化するようにデザインされています。
• トランスフェクションに対応した化学合成RNAにより、クローニングとin vitro転写ステップが不要です。
• ヌクレアーゼ耐性を改善するために、化学修飾が導入されています。

 

Note：オンライン購入のガイドRNA選択では、すべてのデザイン済みガイドRNAは、予想されるノックアウトパフォーマンスの順にランク付けされています。

特長

化学合成シングルガイドRNAは、効率的な遺伝子ノックアウトと高い特異性を提供します。

Edit-Rのデザイン済み化学合成sgRNAは、S. pyogenes由来Cas9ヌクレアーゼを用いたゲノム編集に用いられ、目的のゲノム領域においてCas9を介したDNA二本鎖切断を起こす化学合成ガイドRNAです。

すべてのEdit-RガイドRNAは、挿入または欠失を起こすだけでなく、機能的なタンパク質ノックアウトを効率的に生成するようにアルゴリズムによりデザインされています。さらに、すべてのEdit-R化学合成ガイドRNA製品には化学修飾が導入されおり、ヌクレアーゼによる分解が減少するため、全体的なゲノム編集性能が向上しています。

このような他に類を見ない正確性と効率により、Edit-Rのデザイン済み化学合成sgRNAは、パスウェイ分析や化学合成sgRNAライブラリースクリーニングからのヒットのフォローアップに理想的なツールになります。詳細については、この特集記事をご覧ください。

化学合成sgRNAを使用したEdit-R CRISPR-Cas9ゲノム編集実験に必要なコンポーネント：

• Cas9ヌクレアーゼ（mRNA、タンパク質、発現用プラスミド、または発現用レンチウイルスベクター）
• 目的の遺伝子を標的としてデザインされたEdit-R化学合成sgRNA

大規模な実験には：

ヒトゲノムおよび遺伝子ファミリー全体のスクリーニングのためのデザイン済み化学合成sgRNAライブラリーのアレイ化コレクションをご参照ください。

製品情報

Edit-R デザイン済みSynthetic sgRNA (化学合成sgRNA)

^＊ デザイン済み化学合成sgRNAを3つセットでご提供する製品です。

Edit-R Synthetic sgRNA (化学合成sgRNA)用コントロール

ポジティブコントロールと検出プライマー

特徴のはっきりした遺伝子を標的とする種特異的な化学合成sgRNAおよびミスマッチ検出アッセイプライマーを使用して、ゲノム編集効率を最大化する実験条件を検討します。

Non-targetingコントロール

標的遺伝子特異的sgRNAの非存在下でCRISPR-Cas9コンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価するためのnon-targetingコントロールです。

^＊ DNAミスマッチ検出アッセイにおける検証済みPCRプライマーをセットとしたKit製品です。

^＊＊ Cas9の機能性とcrRNA導入効率のモニター用ポジティブコントロールSynthetic sgRNAです。

サポートデータ

sgRNA必要量

下表は、gRNAワーキング濃度（25nM）を用いて、さまざまなプレート/ウェル形式でリピッドトランスフェクション法を実施できる概算の実験数を示しています。計算では、ピペッティングエラーは考慮されていません。

sgRNA nmol	96-well plate 100 µL reaction volume	24-well plate 500 µL reaction volume	12-well plate 1000 µL reaction volume	6-well plate 2500 µL reaction volume
2	800	160	80	32
5	2000	400	200	80
10	4000	800	400	160

CD4 + T細胞に、標的遺伝子あたり単一のデザイン済み化学合成sgRNAを用いた、タンパク質ノックアウトのフローサイトメトリー分析

Lonza 96-well Shuttleシステムにより、初代ヒトCD4 + T細胞に、標的遺伝子ごとに設計した個別のデザイン済み化学合成sgRNAまたはNon-targetingコントロール（NTC）とCas9からなるRNPをヌクレオフェクションしました。72時間後、FACS分析により、CD28、CD3E、およびCXCR3の機能的ノックアウトを、標的遺伝子を発現していない細胞の割合として評価しました。細胞のCD4発現をAlexa Fluor 488標識抗体で染色して正規化し、APC標識一次抗体を使用してターゲットであるCD28、CD3E、およびCXCR3を比較しました。

CD4 + T細胞に、標的遺伝子あたり単一のデザイン済み化学合成sgRNAを用いた、タンパク質ノックアウトのフローサイトメトリー分析

Lonza 96-well Shuttleシステムにより、初代ヒトCD4 + T細胞に、標的遺伝子ごとに設計した個別のデザイン済み化学合成sgRNAまたはNon-targetingコントロール（NTC）とCas9からなるRNPをヌクレオフェクションしました。72時間後、FACS分析により、CD28、CD3E、およびCXCR3の機能的ノックアウトを、標的遺伝子を発現していない細胞の割合として評価しました。細胞のCD4発現をAlexa Fluor 488標識抗体で染色して正規化し、APC標識一次抗体を使用してターゲットであるCD28、CD3E、およびCXCR3を比較しました。

化学合成sgRNAの混合物（プール）によるFUS遺伝子の機能的ノックアウト

FUSの機能的ノックアウトを、CAGプロモーター下でCas9を恒常的に発現するU2OS細胞で評価しました。0.04 µL DharmaFECT 4を用いて、FUSをターゲットとする3つの異なるEdit-R デザイン済みsgRNAプール（25 nM）を細胞にトランスフェクトしました。トランスフェクションから96時間後に細胞固定後、FUSを標的とする一次抗体およびAlexa Fluor 488蛍光標識二次抗体で染色しました。核識別のためにHoechst染色を使用しました。

化学合成sgRNAはあらゆるタイプのCas9ヌクレアーゼと互換性があります。表に適切なトランスフェクション条件を示します。

Cas9ヌクレアーゼ発現	推奨トランスフェクション試薬
安定発現用Cas9ヌクレアーゼ	化学合成ガイドRNAのトランスフェクション用のDharmaFECT 1、2、3、または4
Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミド	プラスミドおよび化学合成ガイドRNAの同時トランスフェクション用の DharmaFECT Duo
Cas9 mRNAまたはタンパク質NLS	mRNAまたはタンパク質と化学合成ガイドRNAの同時トランスフェクション用の DharmaFECT Duo

各種資料 / 情報

プロトコール

• Cas9ヌクレアーゼmRNA & 化学合成ガイドRNAの導入-エレクトロポレーション
• Cas9ヌクレアーゼタンパク質 & 化学合成ガイドRNAの導入-エレクトロポレーション
• Edit-R Cas9 nuclease protein and synthetic guide RNA transfection – Quick Protocol

テクニカルマニュアル

• Cas9ヌクレアーゼmRNA & 化学合成ガイドRNAの導入
• Cas9 発現用plasmid & 化学合成ガイドRNAの導入
• Cas9ヌクレアーゼタンパク質 & 化学合成ガイドRNAの導入
  

関連リンク

【本社サイト】Edit-R predesigned synthetic sgRNA