デザイン済みSynthetic CRISPR RNA (化学合成crRNA)

化学合成crRNAは、効率的な遺伝子ノックアウトと高い特異性を提供します。

• 目的のターゲット遺伝子の編集（DNA切断）が保証されています。
• タンパク質の機能的ノックアウトの可能性を最大化し、オフターゲット編集を最小化するようにデザインされています。
• トランスフェクションに対応した化学合成RNAにより、クローニングとin vitro転写ステップが不要です。
• ヌクレアーゼ耐性を改善するために、化学修飾が導入されています。

注意：すべての化学合成crRNAは、化学合成tracrRNAと組み合わせて用い、Cas9編集を実現する完全な「ガイドRNA複合体」を形成する必要があります。

Note：オンライン購入のガイドRNA選択では、すべてのデザイン済みガイドRNAは、予想されるノックアウトパフォーマンスの順にランク付けされています。

概要

化学合成crRNAは信頼性の高い遺伝子ノックアウト結果をもたらす機能的および特異的ターゲティングを可能にします。

Edit-R crRNAは化学合成されたRNAであり、ゲノムDNAの標的部位を認識する20ヌクレオチドで構成され、その後に必要なS. pyogenesリピート配列が続きます。ゲノム編集に必要な〜100merのガイドRNA構造全体を完成させるには、crRNAとtracrRNAの複合化が必要です。したがって、化学合成crRNAをご使用の際には、必ずtracrRNAも一緒にご注文ください。

CRISPR-Cas9は遺伝子機能を調べるための非常に効果的なツールですが、すべてのガイドRNAがタンパク質の機能的なノックアウトを実現するのに十分効果的であるとは限りません。この問題に対処するために、Horizo​​nは、挿入または欠失を起こすだけでなく、機能的な遺伝子ノックアウトを生じる可能性が最も高いガイドRNAを選択するように検証されたアルゴリズムを開発しました。

化学修飾がすべてのデザイン済みcrRNAに導入されておりヌクレアーゼによる分解が減少するため、DNA-freeのCas9との同時導入を行うアプリケーションにおいて、ゲノム編集性能が向上しています。詳細については、特集記事をご覧ください。

化学合成crRNAを使用したEdit-R CRISPR-Cas9ゲノム編集実験に必要なコンポーネント：

• Cas9ヌクレアーゼ（タンパク質、mRNA、発現用プラスミド、または発現用レンチウイルスベクター）
• 目的の遺伝子を標的としてデザインされたEdit-R 化学合成CRISPR RNA (crRNA)
• Edit-R trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)

製品情報

Edit-R デザイン済みSynthetic crRNA (化学合成crRNA)

Edit-R Synthetic crRNA (化学合成crRNA)用コントロール

ポジティブコントロールと検出プライマー

特徴のはっきりした遺伝子を標的とする種特異的な化学合成crRNAおよびミスマッチ検出アッセイプライマーを使用して、ゲノム編集効率を最大化する実験条件を検討します。

Non-targetingコントロール

標的遺伝子特異的crRNAの非存在下でCRISPR-Cas9コンポーネントに対するベースラインの細胞応答を評価するためのnon-targetingコントロールです。

ワークフロー

Cas9発現用プラスミドと化学合成crRNA:tracrRNAを用いた遺伝子ノックアウトワークフロー

Cas9発現用レンチウイルス粒子と化学合成crRNA:tracrRNAを用いた遺伝子ノックアウトワークフロー

サポートデータ

crRNAとtracrRNA必要量

この表は、推奨されるcrRNA:tracrRNA作業濃度（25 nM:25nM）を用いて、さまざまなプレート/ウェル形式でリピッドトランスフェクション法を実施できる概算の実験数を示しています。計算では、ピペッティングエラーは考慮されていません。

crRNA nmol	tracrRNA nmol	96-well plate 100 µL reaction volume	24-well plate 500 µL reaction volume	12-well plate 1000 µL reaction volume	6-well plate 2500 µL reaction volume
2	2	800	160	80	32
5	5	2000	400	200	80
10	10	4000	800	400	160
20	20	8000	1600	800	320

化学合成crRNA編集効率

組換えU2OS細胞株で安定的に発現したCas9、およびEdit-R化学合成crRNA:tracrRNAを用いた細胞ベースのアッセイで観察されたVCPタンパク質の機能的ノックアウト

組換えU2OSユビキチン-EGFPプロテアソーム細胞株（Ubi [G76V] -EGFP）に、特定の（図に示した）プロモーターの制御下でCas9を発現するレンチウイルス粒子を形質導入しました。Cas9が安定して組み込まれた細胞集団を、トランスフェクションの最低10日前からブラストサイジン処理で選択しました。DharmaFECT 3 Transfection Reagentを使用して、プロテアソーム機能に必要な遺伝子であるVCPを標的とするEdit-R化学合成crRNA:tracrRNA複合体を細胞に50 nMにてトランスフェクトしました。72時間後、トランスフェクトされた細胞のEGFP +細胞を調べ（上パネル）、T7エンドヌクレアーゼIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイに基づいて、ゲノム編集の相対頻度を計算しました（下パネル）。

化学合成sgRNAおよびcrRNA:tracrRNAのノックアウトパフォーマンス

CAGプロモーター制御下でCas9を安定的に発現するU2OSユビキチン-EGFP細胞株に、プロテアソーム成分PSMD7（A）またはPSMD11（B）を標的とするガイドRNA（crRNA:tracrRNAまたはsgRNA）の濃度を変えてトランスフェクトしました。トランスフェクトされた細胞は、EGFPの蓄積/強度を介して機能的遺伝子ノックアウトについて評価しました。

化学合成crRNA:tracrRNAは、すべてのCas9 Nucleaseフォーマットと互換性がある

U2OS細胞をトランスフェクションの1日前に10,000細胞/ウェルで播種しました。DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬（0.4 uL /ウェル）を使用して、Edit-R Cas9 Nucleaseプラスミド（200 ng）、Edit-R Cas9 Nuclease mRNA（200 ng）またはCas9ヌクレアーゼタンパク質（25 nM）のいずれかを、PPIBをターゲットとするcrRNA:tracrRNA（25 nM）と共にトランスフェクトしました（生物学的トリプリケート）。

Edit-R crRNA:tracrRNAのトランスフェクションによるCas9発現NIH/3T3細胞株での効率的なゲノム編集

NIH/3T3細胞は、特定の（図に示した）プロモーターによって駆動されるCas9およびブラストサイジン耐性遺伝子を含むレンチウイルス粒子で安定的に形質導入されました。 トランスフェクションの10日前からブラストサイジン選抜を行い、Cas9の安定的に導入された細胞集団を選択しました。DharmaFECT 1トランスフェクション試薬を使用して、PPIBをターゲットとする50 nM Edit-R化学合成crRNA:tracrRNAを細胞にトランスフェクトしました。72時間後、T7エンドヌクレアーゼIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイに基づいて、遺伝子編集の相対頻度を計算しました。

デザインアルゴリズムのパフォーマンス

Edit-Rアルゴリズムのスコアが高いcrRNAは、スコアの低いデザインよりも切断効率が高い

10個の遺伝子について、機能スコアが高い10個のcrRNA（青いバー）と、同じ遺伝子について、機能スコアが低い10個のcrRNA（黄緑色のバー）を、次世代シーケンサーによってゲノム編集効率を見るためにテストしました。高スコアのcrRNAの93％について40％以上の編集（挿入または欠失）が確認できました。一方、低スコアのcrRNAの32％について40％以上の編集（挿入または欠失）が確認できました。0.25 µL /ウェルのDharmaFECT 1を使用して、Cas9-HEK293T細胞株に50 nM crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後、細胞を溶解し、各crRNA部位にまたがるNexteraトランスポゾン適合アンプリコンを、処理したサンプルごとに生成しました。トランスフェクトされていないサンプルからのマッチしたコントロールアンプリコンも同時に生成しました。Nextera 96-well index kitを使用してサンプルのインデックスを作成し、MiSeqでのシーケンス用にプールしました。NGS品質フィルタリング基準に合格したリードは、参照ファイル（Bowtie2 v2.1.0）に配列されました。完全なリードの割合が計算され、対照であるトランスフェクトされていないサンプル（Samtools v0.1.12a）に対して正規化されました。 データは編集された割合を正規化して表示しています。

Edit-Rアルゴリズムにおいて機能スコアが高いcrRNAのデザインは、低スコアよりもApoONEアッセイでより強い表現型を示す

CAGプロモーターの下流にCas9が組み込まれたU2OS-プロテアソーム細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり10,000細胞で播種しました。プレーティングの24時間後、0.2 µg /ウェルのDharmaFECT 4を使用して、細胞に25 nM crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。 ApoONEホモジニアスアッセイ（Promega）を使用して、トランスフェクションの48時間後にアポトーシスについて細胞を分析しました。ApoONEアッセイでBCL2L1、PLK1、またはWEE1をターゲットとするcrRNAの機能をボックスプロットで表しています。crRNAを機能スコアに基づいて下半分（H1）と上半分（H2）に分割して、ボックスプロットを作成しました。中央値、下位四分位と上位四分位間のデータの分布、および最小値と最大値は、スコアの高いcrRNAは機能が向上していることを示しています。

ギャップとミスマッチのあるデザインは、オフターゲット切断を引き起こす可能性がある

目的の標的部位を持つcrRNA（GGTCATCTGGGAGAAAAGCG）と、1つのギャップと1つのミスマッチを含みオフターゲットなcrRNA (GGT-ATCTGGGAGAAAAGCA)のT7EIミスマッチ分析です。オフターゲットなcrRNAについて、Edit-Rアライメントツールではギャップとミスマッチが特定されましたが、他のオンラインツールでは特定されませんでした。一般的に使用されるWebベースのcrRNA特異性ツールの多くは、アライメントを実行する際のギャップを完全には考慮していません。

crRNA修飾デザイン

2x MS修飾または非修飾crRNA:tracrRNAによる遺伝子編集の効率

A.ヌクレアーゼによる分解をブロックするための化学修飾は、Cas9 mRNAとcrRNA:tracrRNAの同時エレクトロポレーションを成功させるために必要です。

B. Cas9タンパク質とcrRNA:tracrRNAの同時エレクトロポレーションでは、安定化修飾は必要ありませんが、追加することで結果が改善される場合があります。

Edit-R化学合成ガイドRNAは、in vitroで転写されたガイドRNAと比較して、本質的に自然免疫応答や毒性を引き起こさない

HEK293T Cas9ヌクレアーゼ発現細胞株に、PPIBおよびDNMT3B遺伝子を標的とする異なる化学合成ガイドRNAフォーマット（非修飾crRNA:tracrRNA、5’crRNAと3’ tracrRNAを2xMSで修飾したcrRNA:tracrRNA、crRNAとtracrRNA ともに5’および3’を3xMSで修飾したcrRNA:tracrRNA、そして非修飾化学合成sgRNA、5’および3’を2xMSまたは3xMSで修飾した化学合成sgRNA、およびin vitro転写sgRNA）をトランスフェクションしました。72時間後に、レサズリン還元アッセイ（赤い点）で生存率を評価し、5つの免疫応答遺伝子のレベルをRT-qPCRによって定量化しました。

*MS: 2’-O-メチルヌクレオチドとホスホロチオエート骨格結合

Edit-R化学合成crRNAおよびtracrRNAのヌクレアーゼ耐性を改善するための修飾の位置と構造

A. Edit-R化学合成crRNAおよびtracrRNAでのヌクレアーゼ耐性の修飾の位置。 Edit-R化学合成ガイドRNAは、crRNA（緑色鎖）の5’末端の2つのヌクレオチドとtracrRNA（青い鎖）の3’末端の2つのヌクレオチドに2ʹ-O-methyl (2ʹ-OMe)および骨格ホスホロチオエート結合 (PS)を含みます。

B. 2ʹ-OMeおよびPS骨格のホスホロチオエート結合の構造

Additional References

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Custom designed Edit-R crRNA

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各種資料 / 情報

アプリケーションノート

• A CRISPR-Cas9 gene engineering workflow: generating functional knockouts using Edit-R Cas9 and synthetic crRNA and tracrRNA – Application Note
• Edit-R CRISPR-Cas9システムを用いた相同組み換え修復による蛍光レポーター遺伝子の導入実験
• Microinjection of zebrafish embryos using Dharmacon Edit-R Cas9 Nuclease mRNA, synthetic crRNA, and tracrRNA for genome engineering – Application Note
• Optimization of reverse transfection of Edit-R synthetic crRNA and tracrRNA components with DharmaFECT transfection reagent in a Cas9-expressing cell line – Application Note

ポスター

• Increasing gene editing efficiencies in eukaryotic cell lines by selection of appropriate CRISPR-Cas9 reagents – Poster
• Homology-directed repair with Edit-R CRISPR-Cas9 and single-strand DNA oligos – Poster
• An algorithm for selecting functional and specific CRISPR-Cas9 guide RNAs – Poster
• An algorithm for selecting highly functional and specific guide RNAs for CRISPR-Cas9 gene knockout – Poster
• Complete alignment identification of CRISPR-Cas9 genomic off-targets using Edit-R CRISPR specificity tool – Poster
• CRISPR-Cas9 genome editing utilizing chemically synthesized RNA – Poster
• A Synthetic CRISPR-Cas9 System for Homology-Directed Repair – Poster
• Chemical modifications of synthetic guide RNA for enhanced RNA stability and reduced cellular toxicity in CRISPR-Cas9 genome editing – Poster
• 2′-O-methyl phosphorothioate linkage-modified synthetic guide RNAs for efficient CRISPR-Cas9 genome editing and reduced cellular toxicity – Poster

プロトコール

• Electroporation of Edit-R Cas9 Nuclease mRNA and synthetic guide RNA – Protocol

Cas9ヌクレアーゼmRNA & 化学合成ガイドRNAの導入-エレクトロポレーション

• 化学合成ガイドRNA試薬再溶解プロトコル（チューブ用）の再溶解
• 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.4 – Protocol
• Using Dharmacon Edit-R Fluorescent Cas9 Nuclease mRNA for enrichment of transfected cells – Protocol
• Electroporation of Edit-R Cas9 nuclease protein NLS and synthetic guide RNA for genome engineering – Protocol

Cas9ヌクレアーゼタンパク質 & 化学合成ガイドRNAの導入-エレクトロポレーション

• Edit-R Cas9 mRNA, synthetic guide RNA, and HDR donor template transfection – Quick Protocol
• Edit-R Cas9 nuclease protein and synthetic guide RNA transfection – Quick Protocol

テクニカルマニュアル

• Edit-R CRISPR-Cas9 gene engineering with lentiviral Cas9 particles and synthetic guide RNA – Technical Manual

Cas9 発現用レンチウイルス粒子 & 化学合成ガイドRNAの導入

• Edit-R CRISPR-Cas9 Gene Engineering with Cas9 Nuclease Expression Plasmids and Synthetic RNAs – Technical Manual

Cas9 発現用plasmid & 化学合成ガイドRNAの導入

• Edit-R Inducible Lentiviral Cas9 Nuclease – Technical Manual

Cas9 ヌクレアーゼ誘導発現用レンチウイルス粒子の導入

• Edit-R CRISPR-Cas9 Genome Engineering with Cas9 Nuclease mRNA and Synthetic RNAs – Technical Manual

Cas9ヌクレアーゼmRNA & 化学合成ガイドRNAの導入

• Edit-R Genome Engineering with Cas9 protein and synthetic guide RNAs – Technical Manual

Cas9ヌクレアーゼタンパク質 & 化学合成ガイドRNAの導入

Reading Lists

• In vivo genome engineering with CRISPR-Cas9 – Reading Lists

関連リンク

【本社サイト】Edit-R predesigned synthetic crRNA

Edit-R tracrRNA