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ホーム製品 / サービス情報ゲノム編集試薬CRISPR ガイドRNASynthetic CRISPR RNA (化学合成crRNA)
Edit-R
デザイン済みSynthetic CRISPR RNA (化学合成crRNA)
効率的な遺伝子ノックアウトが実現できる他に類を見ない特異的な化学合成ガイドRNA
  • 目的のターゲット遺伝子の編集が保証されています
  • タンパク質の機能的ノックアウトの可能性を最大化し、オフターゲット編集を最小化するようにデザインされています。
  • トランスフェクションに対応した化学合成RNAにより、クローニングとin vitro転写ステップが不要です。
  • ヌクレアーゼ耐性を改善するために化学修飾がされています。

 

注意:化学合成crRNAは、化学合成tracrRNAと組み合わせて、Cas9編集をターゲットとする完全な“ガイドRNA複合体”を形成する必要があります。

注意:デザイン済みガイドRNAの結果はすべて、予想されるノックアウトパフォーマンスの順にランク付けされています

概要

信頼性の高い遺伝子ノックアウト結果のための機能的および特異的ターゲティング

Edit-R crRNAは化学合成されたRNAであり、ゲノムDNAの標的部位を認識する20ヌクレオチドで構成され、その後に必要なS. pyogenesリピート配列が続きます。ゲノム編集に必要な〜100merのガイドRNA構造全体を完成させるには、crRNAとtracrRNAの複合化が必要です。したがって、化学合成crRNAをご使用の際には、必ずtracrRNAも一緒にご注文ください。

CRISPR-Cas9は遺伝子機能を調べるための非常に効果的なツールですが、すべてのガイドRNAがタンパク質の機能的なノックアウトを達成するのに十分効果的であるとは限りません。この問題に対処するために、Horizo​​nは、挿入または欠失を起こすだけでなく、機能的な遺伝子ノックアウトを生じる可能性が最も高いガイドRNAを選択するように検証されたアルゴリズムを開発しました。

DNAを含まないCas9との同時導入を行うアプリケーションでパフォーマンスを向上させるため、ヌクレアーゼによる分解に抵抗するために、化学修飾がすべてのデザイン済みcrRNAに適用されています。詳細については、この特集記事をご覧ください。

化学合成crRNAを使用したEdit-R CRISPR-Cas9ゲノム編集実験に必要なコンポーネント:
  • Cas9ヌクレアーゼ(発現用プラスミド、mRNA、タンパク質、または発現用レンチウイルスベクター)
  • 目的の遺伝子をターゲットとするようにデザインされたEdit-R化学合成CRISPR RNA (crRNA)
  • Edit-R trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)

 

製品情報

Edit-R デザイン済みSynthetic crRNA (化学合成crRNA)

製品 生物種 Size
Edit-R Synthetic crRNA Human, Mouse, Rat 2, 5, 10, 20 nmol

 

Edit-R Synthetic crRNA (化学合成crRNA)用コントロール

製品 製品タイプ 生物種 Size
ポジティブコントロールcrRNA
Edit-R PPIB Synthetic crRNA Positive Control ポジティブコントロールcrRNAのみ Human,Mouse, Rat 5, 20 nmol
Edit-R DNMT3B Synthetic crRNA Positive Control
Edit-R PPIB crRNA Positive Control Kit ポジティブコントロールcrRNA、およびPCRプライマー
Edit-R DNMT3B crRNA Positive Control Kit
Edit-R Lethal crRNA Control #1, #2 Cas9の機能性とcrRNA導入効率のモニター用 Human,Mouse 5, 20, 50 nmol
ネガティブコントロールcrRNA

Edit-R crRNA Non-targeting Control #1~5

ネガティブコントロールcrRNAのみ 5, 20 nmol

ワークフロー

Cas9発現用プラスミドと化学合成crRNA:tracrRNAを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー
Cas9発現用レンチウイルス粒子と化学合成crRNA:tracrRNAを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー

サポートデータ

サポートデータ

どのくらいのcrRNAとtracrRNAが必要か?

この表は、推奨されるcrRNA:tracrRNA作業濃度(25 nM:25nM)を用いて、さまざまなプレート/ウェル形式でリピッドトランスフェクション法を実施できるおおよその実験数を示しています。計算では、ピペッティングエラーは考慮されません。

化学合成crRNA編集効率

組換えU2OS細胞株で安定的に発現したCas9およびEdit-R化学合成crRNA:tracrRNAを使用した細胞ベースのアッセイで観察されたVCPタンパク質の機能的ノックアウト

 

組換えU2OSユビキチン-EGFPプロテアソーム細胞株(Ubi [G76V] -EGFP)に、特定の(図に示した)プロモーターの制御下でCas9を発現するレンチウイルス粒子を形質導入しました。Cas9が安定して組み込まれた細胞集団を、トランスフェクションの最低10日前からブラストサイジン処理で選択しました。DharmaFECT 3 Transfection Reagentを使用して、プロテアソーム機能に必要な遺伝子であるVCPを標的とするEdit-R化学合成crRNA:tracrRNA複合体を細胞に50 nMにてトランスフェクトしました。72時間後、トランスフェクトされた細胞のEGFP +細胞を調べ(上パネル)、T7エンドヌクレアーゼIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイに基づいて、遺伝子編集の相対頻度を計算しました(下パネル)。

 

化学合成sgRNAおよびcrRNA:tracrRNAのノックアウトパフォーマンス

CAGプロモーター制御下でCas9を安定的に発現するU2OSユビキチン-EGFP細胞株に、プロテアソーム成分PSMD7(A)またはPSMD11(B)を標的とするガイドRNA(crRNA:tracrRNAまたはsgRNA)の濃度を変えてトランスフェクトしました。トランスフェクトされた細胞は、EGFPの蓄積/強度を介して機能的遺伝子ノックアウトについて評価されました。

 

化学合成crRNA:tracrRNAは、すべてのCas9 Nuclease形式と互換性がある。

U2OS細胞をトランスフェクションの1日前に10,000細胞/ウェルで播種しました。 DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬(0.4 uL /ウェル)を使用して、Edit-R Cas9 Nucleaseプラスミド(200 ng)、Edit-R Cas9 Nuclease mRNA(200 ng)またはCas9ヌクレアーゼタンパク質(25 nM)のいずれかを、PPIBをターゲットとするcrRNA:tracrRNA(25 nM)と共にトランスフェクトしました(生物学的トリプリケート)。

 

Edit-R crRNA:tracrRNAのトランスフェクションによるCas9発現NIH / 3T3細胞株での効率的な遺伝子編集

NIH / 3T3細胞は、特定の(図に示した)プロモーターによって駆動されるCas9およびブラストサイジン耐性遺伝子を含むレンチウイルス粒子で安定的に形質導入されました。 トランスフェクションの10日前からブラストサイジン選抜を行い、Cas9の安定的に導入された細胞集団を選択しました。DharmaFECT 1トランスフェクション試薬を使用して、PPIBをターゲットとする50 nM Edit-R化学合成crRNA:tracrRNAを細胞にトランスフェクトしました。72時間後、T7エンドヌクレアーゼIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイに基づいて、遺伝子編集の相対頻度を計算しました。

 

デザインアルゴリズムのパフォーマンス

Edit-Rアルゴリズムのスコアが高いcrRNAは、スコアの低いデザインよりも切断効率が高い

10個の遺伝子について、機能スコアが高い10個のcrRNA(青いバー)と、同じ遺伝子について、機能スコアが低い10個のcrRNA(黄色のバー)を、次世代シーケンサーによってゲノム編集効率を見るためにテストしました。高スコアのcrRNAの93について40%以上の編集(挿入または欠失)が確認できました。一方、低スコアのcrRNAの32%について40%以上の編集(挿入または欠失)が確認できました。0.25 µL /ウェルのDharmaFECT 1を使用して、Cas9-HEK293T細胞株に50 nM crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後、細胞を溶解し、各crRNA部位にまたがるNexteraトランスポゾン適合アンプリコンを、処理したサンプルごとに生成しました。トランスフェクトされていないサンプルからのマッチしたコントロールアンプリコンも同時に生成しました。Nextera 96-well index kitを使用してサンプルのインデックスを作成し、MiSeqでのシーケンス用にプールしました。NGS品質フィルタリング基準に合格したリードは、参照ファイル(Bowtie2 v2.1.0)に配列されました。完全なリードの割合が計算され、コントロールのトランスフェクトされていないサンプル(Samtools v0.1.12a)に対して正規化されました。 データは編集された正規化された割合として表示されます。

Edit-Rアルゴリズムにおいて機能スコアが高いcrRNAのデザインは、低スコアよりもApoONEアッセイでより強い表現型を示す

CAGプロモーターの下流にCas9が組み込まれたU2OS-プロテアソーム細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり10,000細胞で播種しました。プレーティングの24時間後、0.2 µg /ウェルのDharmaFECT4を使用して、細胞に25 nM crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。 ApoONEホモジニアスアッセイ(Promega)を使用して、トランスフェクションの48時間後にアポトーシスについて細胞を分析しました。ApoONEアッセイでBCL2L1、PLK1、またはWEE1をターゲットとするcrRNAの機能をボックスプロットで表しています。crRNAを機能スコアに基づいて下半分(H1)と上半分(H2)に分割して、ボックスプロットを作成しました。中央値、下位四分位と上位四分位間のデータの分布、および最小値と最大値は、スコアの高いcrRNAは機能が向上していることを示しています。

ギャップとミスマッチのあるデザインは、オフターゲット切断を引き起こす可能性がある

目的の標的部位を持つcrRNA(GGTCATCTGGGAGAAAAGCG)と、1つのギャップと1つのミスマッチを含みオフターゲットなcrRNA (GGT-ATCTGGGAGAAAAGCA)のT7EIミスマッチ分析。オフターゲットなcrRNAについて、Edit-Rアライメントツールではギャップとミスマッチが特定されましたが、他のオンラインツールでは特定されませんでした。一般的に使用されるWebベースのcrRNA特異性ツールの多くは、アライメントを実行する際のギャップを完全には考慮していません。

 

crRNA修飾デザイン

2x MS修飾または非修飾crRNA:tracrRNAによる遺伝子編集の効率

A.ヌクレアーゼによる分解をブロックするための変更は、Cas9 mRNAとcrRNA:tracrRNAの同時エレクトロポレーションを成功させるために必要です。

B. Cas9タンパク質とcrRNA:tracrRNAの同時エレクトロポレーションでは、安定化修飾は必要ありませんが、追加することで結果が改善される場合があります。

 

Edit-R化学合成ガイドRNAは、in vitroで転写されたガイドRNAと比較して、本質的に自然免疫応答や毒性を引き起こさない。

HEK293T Cas9ヌクレアーゼ発現細胞株に、PPIBおよびDNMT3B遺伝子を標的とする異なる化学合成ガイドRNAフォーマット(非修飾crRNA:tracrRNA、5’crRNAと3’ tracrRNAを2xMSで修飾したcrRNA:tracrRNA、crRNAとtracrRNA ともに5’および3’を3xMSで修飾したcrRNA:tracrRNA、そして非修飾化学合成sgRNA、5’および3’を2xMSまたは3xMSで修飾した化学合成sgRNA、およびin vitro転写sgRNA)をトランスフェクションしました。72時間後に、レサズリン減少アッセイ(赤い点)で生存率を評価し、5つの免疫応答遺伝子のレベルをRT-qPCRによって定量化しました。

*MS: 2’-O-メチルヌクレオチドとホスホロチオエート骨格結合。

 

Edit-R化学合成crRNAおよびtracrRNAのヌクレアーゼ耐性を改善するための修飾の位置と構造

A. Edit-R化学合成crRNAおよびtracrRNAでのヌクレアーゼ耐性の修飾の位置。 Edit-R化学合成ガイドRNAは、crRNA(緑色鎖)の5’末端の2つのヌクレオチドとtracrRNA(青い鎖)の3’末端の2つのヌクレオチドに2ʹ-O-methyl (2ʹ-OMe)および骨格ホスホロチオエート結合 (PS)を含みます。

B. 2ʹ-OMeおよびPS骨格のホスホロチオエート結合の構造。

 

Additional References

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Custom designed Edit-R crRNA
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  4. K. He, E. Chou, et al. Conjugation and evaluation of triazole-linked single guide RNA for CRISPR-Cas9 gene editing. ChemBioChem. 17, 1809–1812 (2016).doi:10.1002/cbic.201600320

仕様

出荷条件 室温
保管条件 -20 C
推奨保管条件での安定性 少なくとも 12 か月
危険有害性 無し

各種資料 / 情報

アプリケーションノート
ポスター
プロトコール

Cas9ヌクレアーゼmRNA & 化学合成ガイドRNAの導入-エレクトロポレーション

Cas9ヌクレアーゼタンパク質 & 化学合成ガイドRNAの導入-エレクトロポレーション

テクニカルマニュアル

Cas9 発現用レンチウイルス粒子 & 化学合成ガイドRNAの導入

Cas9 発現用plasmid & 化学合成ガイドRNAの導入

Cas9 ヌクレアーゼ誘導発現用レンチウイルス粒子の導入

Cas9ヌクレアーゼmRNA & 化学合成ガイドRNAの導入

Cas9ヌクレアーゼタンパク質 & 化学合成ガイドRNAの導入

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関連リンク

【本社サイト】Edit-R predesigned synthetic crRNA