効果的かつ正確な遺伝子ノックアウトを実現するシングルガイドRNA発現ベクター
- 目的のターゲット遺伝子の編集が保証されています。
- 形質導入に対応したガイドRNAにより、クローニングとin vitro転写ステップが不要です。
- タンパク質の機能的ノックアウトの可能性を最大化し、オフターゲット編集を最小化するようにデザインされています。
- レンチウイルス粒子あるいは大腸菌グリセロールストックをご用意しています。
注意：デザイン済みガイドRNAの結果はすべて、予想されるノックアウトパフォーマンスの順にランク付けされています
概要
信頼性の高い遺伝子ノックアウト結果のための機能的および特異的ターゲティング
Edit-RレンチウイルスsgRNAは、Cas9ヌクレアーゼによる標的DNAの二本鎖切断をガイドするためのRNAを発現します。Edit-RレンチウイルスsgRNAベクターバックボーンでは、遺伝子特異的ガイドRNAはヒトU6プロモーターの制御下で発現されますが、ピューロマイシン耐性マーカー（PuroR）の発現はマウスCMVプロモーターから駆動され、sgRNAが組み込まれた細胞の迅速な選択を可能にします。
各Edit-RレンチウイルスsgRNAは、目的の遺伝子およびゲノム部位に特異的です。トランスフェクションが困難な細胞でノックアウトを起こす、またはプールされたレンチウイルスsgRNAライブラリースクリーニングからのヒットをフォローアップすることなどが、主要なこのガイドフォーマットの使用方法です。
CRISPR-Cas9は遺伝子機能を調べるための非常に効果的なツールですが、すべてのガイドRNAがタンパク質の機能的なノックアウトを実現するのに有効であるとは限りません。この問題に対処するために、Horizonは、挿入または欠失を起こすだけでなく、機能的な遺伝子ノックアウトを生じる可能性が最も高いガイドを選択するように検証されたアルゴリズムを開発しました。
製品情報
デザイン済みEdit-R Lentiviral sgRNA (レンチウイルスsgRNA)
| 製品 | 生物種 | プロモーター | Size |
|---|---|---|---|
| Edit-R Lentiviral sgRNA | Human,
Mouse |
mCMV | 100 µL, 10^8 TU/mL |
| 200 µL, 10^8 TU/mL | |||
| glycerol stock＊2 | |||
| Edit-R Set of 3 Lentiviral sgRNA＊1 | 100 µL, 10^8 TU/mL x 3 | ||
| 200 µL, 10^8 TU/mL x 3 | |||
| glycerol stock x 3＊2 |
＊1 お好みのデザイン済みsgRNA発現用レンチウイルスを3つセットでご提供する製品です。
＊2 sgRNAを発現するレンチウイルスベクターを導入した大腸菌の培養液にグリセロールを加えたものです。レンチウイルスベクターのパッケージングにはTrans-Lentiviral Packaging Kit がおすすめです。
Edit-R lentiviral sgRNA (レンチウイルスsgRNA)用コントロール
| 製品 | 製品タイプ | 生物種 | Size |
|---|---|---|---|
| ポジティブコントロールsgRNA | |||
| Edit-R PPIB Lentiviral sgRNA Positive Control | ポジティブコントロールsgRNAのみ | Human,
Mouse |
2 x 25 µL, 10^8 TU/mL, glycerol stock＊ |
| Edit-R DNMT3B Lentiviral sgRNA Positive Control | |||
| Edit-R PPIB Lentiviral sgRNA Positive Control Kit | ポジティブコントロールsgRNA、
およびPCRプライマー |
||
| Edit-R DNMT3B Lentiviral sgRNA Positive Control Kit | |||
| ネガティブコントロールsgRNA | |||
|
Edit-R Lentiviral sgRNA Non-targeting Control #1～10 |
ネガティブコントロールcrRNAのみ | － | 2 x 25 µL, 10^8 TU/mL,
glycerol stock＊ |
＊ sgRNAを発現するレンチウイルスベクターを導入した大腸菌の培養液にグリセロールを加えたものです。レンチウイルスベクターのパッケージングにはTrans-Lentiviral Packaging Kitがおすすめです。
ワークフロー
Edit-RレンチウイルスsgRNAを使用した実験的ワークフロー
Edit-Rレンチウイルス遺伝子工学システムは、Cas9ヌクレアーゼとシングルガイドRNAを2段階のプロセスで利用します。まず、Edit-RレンチウイルスCas9ヌクレアーゼ発現粒子を使用して、Cas9ヌクレアーゼを安定して発現する細胞株を作製します。その後、これらの細胞にEdit-RレンチウイルスsgRNA粒子を形質導入して、、細胞集団または単離されたクローン細胞株の表現型解析のための効率的なゲノム編集（低MOIであっても）を実現できます。
サポートデータ
さまざまなプロモーターの制御下でCas9を使用してゲノム編集をテストすると、複数の細胞株でEdit-RレンチウイルスsgRNAを使用して高レベルの遺伝子編集が実現できることがわかる。
さまざまなプロモーターの制御下でCas9を使用して遺伝子編集をテストすると、複数の細胞株でEdit-RレンチウイルスsgRNAを使用して高レベルの遺伝子編集が実現できることがわかります。組換えU2OSユビキチン-EGFPプロテアソーム細胞株（Ubi [G76V] -EGFP）とHEK293T細胞は、Cas9とブラストサイジン耐性遺伝子を含むレンチウイルス粒子で安定的に形質導入されました。安定的に形質導入された細胞の集団は、sgRNAの形質導入の前に最低10日間ブラストサイジンで選択されました。低MOIでsgRNAレンチウイルス粒子を細胞に形質導入して、細胞当たり1つのsgRNA配列を有する細胞を得て、分析の前に7日間ピューロマイシンで選択しました。ピューロマイシン選択細胞におけるゲノム編集の相対頻度は、T7エンドヌクレアーゼIを使用したDNAミスマッチ検出アッセイから計算されました。
Edit-RレンチウイルスsgRNAベクターのプラスミドベクター要素の概略図
Edit-RレンチウイルスsgRNAベクターバックボーンでは、遺伝子特異的なsgRNAはヒトU6プロモーターの制御下で発現します。ピューロマイシン耐性マーカー（PuroR）の発現はマウスCMVプロモーターから駆動され、sgRNAが組み込まれた細胞の迅速な選択を可能にします。このプラスミドには、大腸菌での増殖と選択のためのアンピシリン耐性マーカーが含まれています。
アルゴリズムは化学合成crRNAと発現sgRNAの両方に適用されうる
ここでは、12の異なるサイトで遺伝子PSMD11をターゲットにし、プロテアソームの破壊を示すEGFPシグナルによって機能を測定しています。細胞に、crRNA:tracrRNAsをトランスフェクトするか、crRNAと同じターゲット配列を含むsgRNAを発現するレンチウイルス粒子を形質導入しました。同じゲノム部位をターゲットとする場合、2つのガイドRNAフォーマットの間に機能の大きな違いはありませんでした。。
仕様
| 出荷条件 | ドライアイス、またはジェル保冷剤 |
| 保管条件 | -80 C |
| 推奨保管条件での安定性 | 少なくとも 12 か月 |
| 危険有害性 | 無し |
各種資料 / 情報
プロトコール：sgRNA発現用レンチウイルスベクター大腸菌グリセロールストックの使用法（英語）
テクニカルマニュアル：Cas9 発現用レンチウイルス粒子 & sgRNA発現用レンチウイルス粒子の導入（英語）
Cas9 発現用レンチウイルス粒子 & sgRNA発現用レンチウイルス粒子の導入
テクニカルマニュアル：Cas9 ヌクレアーゼ誘導発現用レンチウイルス粒子の導入（英語）
Cas9 ヌクレアーゼ誘導発現用レンチウイルス粒子の導入
アプリケーションノート：Edit-R CRISPR-Cas9試薬と一本鎖DNAドナーオリゴ相同組換え修復（英語）
ポスター：Edit-R CRISPR-Cas9と一本鎖DNAオリゴによる相同組換え修復（英語）
ポスター：機能的で特異的なCRISPR-Cas9ガイドRNAを選択のためのアルゴリズム（英語）
関連リンク
【本社サイト】Edit-R predesigned Lentiviral sgRNA
CRISPR Design Tool
お客様自身でcrRNAあるいはsgRNAを設計・注文いただくWebツールです。
Cas9ヌクレアーゼ
DharmaFECTトランスフェクション試薬
DharmaFECT 1～4は、細胞にあわせて最適条件で使い分ける4種類の低分子RNA（crRNA、tracrRNAを含む）用トランスフェクション試薬です。