デザイン済みAll-in-one Lentiviral sgRNA

sgRNAとCas9ヌクレアーゼの発現を1つのベクターに組み合わせ、導入を簡素化

• 目的の標的遺伝子の編集（DNA切断）が保証されています。
• ピューロマイシン耐性と蛍光レポーターを用いた濃縮が可能です。
• 形質導入に対応したガイドRNAにより、クローニングとin vitro転写ステップが不要です。
• タンパク質の機能的ノックアウトの可能性を最大化し、オフターゲット編集を最小化するようにデザインされています。

Note：オンライン購入のガイドRNA選択では、すべてのデザイン済みガイドRNAは、予想されるノックアウトパフォーマンスの順にランク付けされています。

• グリセロールストックおよび高力価精製粒子をご用意しています。

特長

必要なすべてのコンポーネントを単一の試薬に組み合わせて、信頼性の高い遺伝子ノックアウトを実現します。

Edit-R All-in-oneレンチウイルスシステムを用いて、ノックアウト細胞株を簡単に作製できます。遺伝子特異的ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼの両方を発現する単一のベクターを使用すると、逐次の形質導入を実行する必要がなくなります。

このガイドフォーマットは、トランスフェクションが困難な細胞タイプでノックアウトを作製するため、またはプール化レンチウイルスsgRNAライブラリーを用いるスクリーニング後のヒットをフォローアップするために最も使用されます。

ピューロマイシン耐性遺伝子またはEGFPマーカーを選択することで、ベクターの組み込みに成功した細胞を選択できます。蛍光が発現するとすぐにFACS分析を実行できるため、編集した細胞を迅速に濃縮するには、EGFP選択マーカーをお勧めします。これは、初代細胞など生存期間の短い細胞タイプの場合に特に役立ちます。

Edit-R デザイン済みAll-in-oneレンチウイルスsgRNAは、次の製品形態でご用意しています。

• 高品質の精製された濃縮レンチウイルス粒子（10⁷ TU/mL以上）は、精製物中の毒性のあるデブリや夾雑物なしに、細胞に直接形質導入することができます。
• グリセロールストックは、ウイルスパッケージングに使用できます。

Edit-Rのガイドデザイン

CRISPR-Cas9は遺伝子機能を調べるための非常に効果的なツールですが、すべてのガイドRNAがタンパク質の機能的なノックアウトを実現するのに十分効果的であるとは限りません。この問題に対処するために、Horizo​​nは、挿入または欠失を起こすだけでなく、機能的な遺伝子ノックアウトを生じる可能性が最も高いガイドを選択するように検証されたアルゴリズムを開発しました。広範なテストにより、このアプローチはノックアウト効率と特異性の比類のない組み合わせを提供することが示されています。

製品情報

デザイン済みEdit-R All-in-one Lentiviral sgRNA

製品	Selection	生物種	プロモーター	Size
Edit-R All-in-one Lentiviral sgRNA	Puromycin 耐性遺伝子, EGFP	Human, Mouse	mCMV, hEF1α	100 µL, 10^7 TU/mL
				200 µL, 10^7 TU/mL
				glycerol stock＊2
Edit-R All-in-one Set of 3 Lentiviral sgRNA＊1				100 µL, 10^7 TU/mL x 3
				200 µL, 10^7 TU/mL x 3
				glycerol stock x 3＊2

＊1 お好みのデザイン済みsgRNA発現用レンチウイルスを3つセットでご提供する製品です。

＊2 sgRNAを発現するレンチウイルスベクターを導入した大腸菌の培養液にグリセロールを加えたものです。レンチウイルスベクターのパッケージングにはTrans-Lentiviral Packaging Kit がおすすめです。

Edit-R All-in-one lentiviral sgRNA用コントロール

ポジティブコントロールと検出プライマー

All-in-oneレンチウイルスsgRNA用コントロールを使用して、DNA二本鎖切断と遺伝子編集効率を検証します。

Non-targetingコントロール

All-in-oneレンチウイルスsgRNAコンストラクトは、ヒト、マウス、またはラットのゲノム内の遺伝子を標的としないように生物情報学的に設計および検証されています。

ワークフロー

Edit-R All-in-oneレンチウイルスsgRNAシステムを用いた遺伝子ノックアウトワークフロー

混合細胞集団（左側）またはクローン細胞株（右側）の実験的アプローチを使用したAll-in-oneレンチウイルスsgRNAによる遺伝子ノックアウトワークフロー

サポートデータ

Edit-R All-in-oneレンチウイルスシステムを用いた場合の編集頻度（TIDE）

JurkatまたはK562細胞に、CD3またはCD28遺伝子のいずれかを標的とするEdit-R All-in-one EGFPレンチウイルスsgRNAベクターを用いて、0.3 MOIで形質導入しました。All-in-oneレンチウイルス粒子は、hEF1αまたはmCMVプロモーターの下で構成的にCas9ヌクレアーゼを発現します。Non-targetingコントロール（NTC）ガイドを発現するレンチウイルス粒子をネガティブコントロールとして使用しました。レンチウイルスの形質導入と増殖の後、細胞をソーティングせず細胞集団（Pool）として分析するか、またはソーティングを行って、最も明るい（Top）または最も暗い（Dim）EGFP発現細胞集団を濃縮しました。次に、細胞のPool、Top、およびDimの集団をTIDE分析にかけ、ゲノム編集の割合を評価しました。

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Edit-Rの 2ベクターシステムとAll-in-oneシステムの比較

2ベクターシステムの場合、hEF1αまたはmCMVの制御下でCas9を構成的に発現するためのレンチウイルス粒子を細胞に0.3 MOIで形質導入し、10 µg / mLブラストサイジンで10日間選択した後、All-in-one Non-targetingコントロール（NTC）あるいは、DNMT3BまたはPPIBをターゲットとするsgRNAレンチウイルス粒子を0.3 MOIで形質導入しました。All-in-oneシステムでは、All-in-one Non-targetingコントロール（NTC）あるいは、DNMT3BまたはPPIBをターゲットとするAll-in-oneレンチウイルスsgRNAを野生型細胞に0.3 MOI にて形質導入し、2 µg / mLピューロマイシンで3日間選択しました。次に、細胞を溶解し、T7EIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイを使用してindel（挿入・欠失）を分析しました。

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Edit-R All-in-one Lentiviral sgRNAのベクターマップ

Edit-R All-in-one Lentiviral sgRNAベクターバックボーンでは、遺伝子特異的ガイドRNAはヒトU6プロモーターの制御下で発現し、Cas9およびピューロマイシン耐性マーカー（PuroR）またはEGFPマーカーの発現はヒトEF1αまたはマウスCMVプロモーターのいずれかから駆動されます。プラスミドには、大腸菌での増殖と選択のためのアンピシリン耐性マーカーが含まれています。

Vector Element	Utility
Cas9	Human codon-optimized S. pyogenes Cas9 nuclease for cleavage of targeted DNA when programmed with a sgRNA
T2A	Self-cleaving peptide allows for simultaneous expression of puromycin resistance and Cas9 protein from a single transcript
PuroR	Puromycin resistance marker permits antibiotic selection of transduced mammalian cells
EGFP	Fluorescent marker permits FACS selection of transduced mammalian cells
mCMV	Mouse cytomegalovirus immediate early promoter
hEF1α	Human elongation factor 1 alpha short promoter
U6	Human RNA polymerase III promoter U6
sgRNA	Optimized single guide RNA, a fusion of gene-specific crRNA with the tracrRNA scaffold
5′ LTR	5′ Long Terminal Repeat necessary for lentiviral particle production and integration of the construct into the host cell genome
Ψ	Psi packaging sequence allows lentiviral genome packaging using lentiviral packaging systems
RRE	Rev Response Element enhances titer by increasing packaging efficiency of full-length lentiviral genomes
WPRE	Woodchuck Hepatitis Post-transcriptional Regulatory Element enhances transgene expression in target cells
3′ SIN LTR	3′ Self-inactivating Long Terminal Repeat for generation of replication-incompetent lentiviral particles
SV40 pA	Simian virus 40 polyadenylation signal
pUC ori	pUC origin of replication
SV40 ori	Simian virus 40 origin of replication
AmpR	Ampicillin resistance gene for vector propagation in E. coli cultures

各種資料 / 情報

プロトコール

•  Lentiviral titering by crystal violet staining – Protocol

テクニカルマニュアル

•  Edit-R CRISPR-Cas9 Gene Engineering with All-in-One Lentiviral Cas9 and sgRNA – Technical Manual

関連リンク

【本社サイト】Edit-R All-in-one Lentiviral sgRNA