CRISPR ガイドRNA
概要
ガイドRNAは特定のゲノム位置で切断するようにCas9ヌクレアーゼをプログラムします。効率的な遺伝子ノックアウトを実現するには、効果的なガイドRNAのデザインが重要です。
すべてのEdit-Rデザイン済みガイドRNA製品は、二本鎖DNA切断を起こすだけでなく、タンパク質の機能的なノックアウトの可能性を最大化するための検証済みアルゴリズムを使用してデザインされています。数千の配列デザインを用いて表現型を評価し、他のアッセイシステムでデザインルールを検証することにより、特異性が高く機能的なノックアウトを実現する可能性の高い、ターゲットサイトを決定するための基準を確立しました。
化学合成およびレンチウイルスのガイドRNAは、CRISPR Design Toolを使用して、様々な生物種に対して、代替ヌクレアーゼ対応用に、または遺伝子内の特定の領域に合わせてカスタム設計することもできます。切断にS. aureus由来の Cas9 を使用するガイド RNA を設計する場合、Horizon はヌクレアーゼに NEB EnGen® Sau Cas9 を推奨しています。
CRISPR-Cas9システムにおけるガイドRNAの働き
CRISPR-Cas9システムは、Cas9ヌクレアーゼの発現に加えて、特定のRNA分子（ガイドRNA）を必要とします。ガイドRNAは、Cas9ヌクレアーゼをリクルートして目的のDNA領域に向かわせます。これらのガイドRNAは、次の2つの形式のいずれかをとります。
- 化学合成trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)と、目的の遺伝子ターゲット配列を切断するようにデザインされた化学合成CRISPR RNA (crRNA)の組み合わせ（図1a）
- 単一のコンストラクトとしてcrRNAとtracrRNAの両方で構成される化学合成または発現されたシングルガイドRNA (sgRNA)（図1b）
図1a crRNA:tracrRNA複合体によってプログラムされたCas9ヌクレアーゼが、PAM配列の上流5’側二本鎖DNAを切断する。
図1b sgRNAによってプログラムされたCas9ヌクレアーゼが、PAM配列の上流5’側二本鎖DNAを切断する。
製品情報
Edit-R デザイン済みガイドRNA
標的遺伝子の編集（DNA切断）が保証されています。
Synthetic sgRNA (化学合成sgRNA)
シングルガイドフォーマット。複雑でゲノム編集が難しい細胞タイプに効果的です。
Synthetic crRNA (化学合成crRNA )
多くの細胞タイプで使用できる効率的なゲノム編集方法。化学合成tracrRNAと組み合わせて使用します。
Lentiviral sgRNA (レンチウイルスsgRNA)
トランスフェクションの困難な細胞において安定的にガイドRNAを発現します。
All-in-one Lentiviral sgRNA
sgRNAとCas9ヌクレアーゼ両方を発現するレンチウイルスベクター
カスタムガイドRNA
40種以上の生物種に対応したガイドRNA、または代替ヌクレアーゼと共に使用するガイドRNAをデザインできます。
ガイド RNA 配列が既に決まっており、それを化学合成する場合はこちらから
目的遺伝子の特定領域を標的としたガイドRNAをデザインする場合はこちらから
製品選択ガイド
実験に最適なガイドRNAタイプの決定は、実施するアプリケーションと細胞の種類によって異なります。表を参考に、特定の実験条件に適したガイドRNAフォーマットの選択をしてください。
| 化学合成
crRNA |
化学合成
sgRNA |
レンチウイルス
sgRNA |
レンチウイルス
All-in-one sgRNA |
|
|---|---|---|---|---|
| 目的の遺伝子のゲノム編集（DNA切断）が保証されている（デザイン済み製品に限る） | ✔ | ✔ | ✔ | ✔ |
| 様々な細胞種、ヌクレアーゼ、ゲノム編集位置に合わせてカスタム設計が可能 | ✔ | ✔ | ✔ | ✔ |
| エレクトロポレーションに対応したリボヌクレオタンパク質（Ribonucleoprotein：RNP） | ✔ | ✔ | ||
| エレクトロポレーションできないゲノム編集が困難な細胞への形質導入 | ✔ | ✔ | ||
| 抗生物質耐性マーカーによる細胞濃縮 | ✔ | ✔ | ||
| ワークフローを簡素化するためのAll-in-oneベクター（sgRNA + Cas9）が利用可能 | ✔ |
サポートデータ
Edit-Rアルゴリズムのスコアは、切断効率と相関する
10個の遺伝子について、機能スコアが高い10個のcrRNA（青いバー）と、同じ遺伝子について、機能スコアが低い10個のcrRNA（黄緑色のバー）を、次世代シーケンサーによってゲノム編集効率を見るためにテストしました。高スコアのcrRNAの93％について40％以上の編集（挿入または欠失）が確認できました。一方、低スコアのcrRNAの32％について40％以上の編集（挿入または欠失）が確認できました。0.25 µL /ウェルのDharmaFECT 1を使用して、Cas9-HEK293T細胞株に50 nM crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後、細胞を溶解し、各crRNA部位にまたがるNexteraトランスポゾン適合アンプリコンを、処理したサンプルごとに生成しました。トランスフェクトされていないサンプルからのマッチしたコントロールアンプリコンも同時に生成しました。Nextera 96-well index kitを使用してサンプルのインデックスを作成し、MiSeq（ペアエンドリード、リード長2 x 300bp）でのシーケンス用にプールしました。NGS品質フィルタリング基準に合格したリードは、参照ファイル（Bowtie2 v2.1.0）に配列されました。完全なリードの割合が計算され、対照であるトランスフェクトされていないサンプル（Samtools v0.1.12a）に対して正規化されました。 データは編集された割合を正規化して表示しています。
アルゴリズムの機能スコアが高いcrRNAは、他の機能アッセイでも良好に機能する
CAGプロモーターの下流にCas9が組み込まれたU2OS-プロテアソーム細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり10,000細胞で播種しました。プレーティングの24時間後、0.2 µg /ウェルのDharmaFECT 4を使用して、細胞に25 nM crRNA:tracrRNAをトランスフェクトしました。 ApoONEホモジニアスアッセイ（Promega）を使用して、トランスフェクションの48時間後にアポトーシスについて細胞を分析しました。ApoONEアッセイでBCL2L1、PLK1、またはWEE1をターゲットとするcrRNAの機能をボックスプロットで表しています。crRNAを機能スコアに基づいて下半分（H1）と上半分（H2）に分割して、ボックスプロットを作成しました。中央値、下位四分位と上位四分位間のデータの分布、および最小値と最大値は、スコアの高いcrRNAは機能が向上していることを示しています。