Lentiviral Cas9ヌクレアーゼ試薬
研究に最も合致する細胞タイプを用いたゲノム編集のためのレンチウイルス CRISPR-Cas9コンポーネント
Cas9ヌクレアーゼ安定発現細胞株作製に用いるレンチウイルス粒子あるいは大腸菌グリセロールストックをご用意しています。
特長
CRISPR-Cas9システムにおけるCas9ヌクレアーゼ
CRISPR関連酵素Cas9ヌクレアーゼは、ゲノムDNAの標的認識とDNA二重鎖切断（DSB）のためにガイドRNAを必要とするRNA-guidedエンドヌクレアーゼです。
Lentiviral Cas9ヌクレアーゼ試薬は、Cas9ヌクレアーゼを発現する細胞株を迅速に作製し、プール化レンチウイルスsgRNAライブラリーを用いたスクリーニング、アレイ化crRNAライブラリーを用いたスクリーニング、または単一遺伝子または複数遺伝子を標的とする複数のガイドRNAの評価など、多くのゲノム編集アプリケーションに使用されています。
Lentiviral Cas9ヌクレアーゼ発現ベクターには、さまざまな構成型または誘導型プロモーターの制御下にあるS. pyogenes Cas9ヌクレアーゼのヒトコドン最適化バージョンが含まれています。精製されたレンチウイルス粒子またはプラスミドDNAとしてご提供しています。
Lentiviral Cas9ヌクレアーゼ 発現ベクターのハイライト
- ブラストサイジン耐性マーカー（BlastR）または蛍光マーカー（mKate2 または TurboGFP™）を選択できます。
- 最小1ｘ107 TU/mL以上の機能力価を持つ、即時形質導入用の濃縮精製レンチウイルス粒子として提供されます。
- 独自のレンチウイルス粒子を生産するためのパッケージング細胞株への直接トランスフェクション用の認証されたエンドトキシンフリープラスミドDNAとしても利用可能です。
- 6 つのSMARTchoice構成プロモーターのいずれかを使用してコンストラクトをカスタマイズし、目的の細胞株でCas9の発現を最適化できます。
- Cas9の発現を一時的に制御する必要がある場合、または最小限のバックグラウンド発現で安定した細胞株を作製する場合は、誘導型Cas9ベクターの厳密な制御を利用します。
すべてのRNA pol IIプロモーターが異なる細胞環境で同等にアクティブではない
Cas9ヌクレアーゼの転写を制御する任意のプロモーターの活性は、生物系によって大きく異なる可能性があり、Cas9の発現レベルが変化し、ひいてはDNA編集のレベルが変化します。したがって、細胞株または細胞タイプに最適なプロモーターを選択することは、実験におけるゲノム編集の程度に影響します。実験に最適なプロモーターの決定については、SMARTchoice promoter selection plateを参照してください。
Cas9ヌクレアーゼを発現するためのSMARTchoiceプロモーターオプション
| Promoter | Description |
|---|---|
| hCMV | human cytomegalovirus immediate early promoter |
| mCMV | mouse cytomegalovirus immediate early promoter |
| hEF1α | human elongation factor 1 alpha promoter |
| mEF1α | mouse elongation factor 1 alpha promoter |
| PGK | mouse phosphoglycerate kinase promoter |
| CAG | chicken beta actin hybrid promoter |
| TRE3G | doxycycline-inducible promoter |
製品情報
| 製品 | プロモーター | 蛍光レポーター | Size |
|---|---|---|---|
| Blasticidin耐性マーカー発現用 | |||
|
Lentiviral Blast-Cas9 Nuclease Particles |
hCMV, mCMV, hEF1α, mEF1α, PGK, CAG |
－ | 50 µL, 10^7 TU/mL |
|
Lentiviral Blast-Cas9 Nuclease Plasmid DNA＊ |
10 µg | ||
| 蛍光レポーター同時発現用 | |||
| Lentiviral Fluorescent Cas9 Nuclease Particles |
hCMV, mCMV, hEF1α |
mKate2, TurboGFPTM |
50 µL, 10^7 TU/mL |
| Lentiviral Fluorescent Cas9 Nuclease Plasmid DNA＊ | 10 µg | ||
| Cas9ヌクレアーゼ誘導発現用 | |||
| Inducible Lentiviral hEF1a-Blast-Cas9 Nuclease Particle | hEF1α | － | 50 µL, 10^7 TU/mL |
| Inducible Lentiviral hEF1a-Blast-Cas9 Nuclease Plasmid DNA＊ | 10 µg | ||
＊ Lentiviral Cas9 Nuclease Particlesの作成（パッケージング）の元となるプラスミドDNAです。プラスミドDNAのパッケージングにはTrans-Lentiviral ORF Packaging Kitをご使用ください。
TurboGFPはEvrogen Inc.の商標です。
ワークフロー
Lentiviral Cas9ヌクレアーゼ試薬フォーマットのゲノム編集ワークフロー
Lentiviral Cas9ヌクレアーゼとEdit-R Lentiviral sgRNAを使用した遺伝子ノックアウトのワークフロー
ゲノム編集は、プール細胞を用いたアプローチ（左側）で、通常は遺伝子ノックアウトスクリーニングが行われます。または、より明確な細胞タイプを調べたい場合は、クローン化細胞株を用いたアプローチ（右側）で表現型分析を実行します。
Edit-R Lentiviral sgRNAを使用した誘導型Lentiviral Cas9ヌクレアーゼを使用した遺伝子ノックアウトのワークフロー
Lentiviral Cas9ヌクレアーゼとEdit-R 化学合成ガイドRNAを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー
プール化Lentiviral sgRNAライブラリーを用いたスクリーニングにおける、誘導性Lentiviral Cas9ヌクレアーゼを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー
サポートデータ
Lentiviral蛍光Cas9ヌクレアーゼ データ
蛍光Lentiviral Cas9ヌクレアーゼにより、高発現細胞の濃縮とCRISPR-Cas9遺伝子編集効率の向上が可能
U2OS 細胞に、Edit-R Lentiviral hCMV mKate2-Cas9ヌクレアーゼ粒子（カタログ番号：VCAS11869)）を低感染多重度（MOI = 0.3）で形質導入し、形質導入された細胞にCas9が1つだけ組み込まれるようにしました。細胞をFACS解析のために増殖し、細胞集団をmKate2蛍光negative、low、medium、highに分けソーティングしました。これらの亜集団を増殖し、96ウェルプレートに10,000細胞／ウェルで播種しました。1日後、tracrRNA（25 nM、カタログ番号：U-002005-xx）、および Edit-R PPIB Synthetic crRNA Control（カタログ番号：U-007501-xx）または Edit-R MYC Predesign crRNA（カタログ番号：CM- 003282-01）DharmaFECT 1トランスフェクション試薬（0.3 µL/ウェル、カタログ番号：T-2001-01）を使用してトランスフェクトしました。 72時間後、In Cell Analyzer 2200（GE Healthcare; A）を使用して細胞をmKate2蛍光を画像化し、DNAミスマッチ検出アッセイのために収集して、ゲノム編集を評価しました (B)。mKate2の高発現は、PPIBおよびMYCを標的とするcrRNAのより高いゲノム編集効率と関連づけられると思われます。
Lentiviral誘導性Cas9ヌクレアーゼデータ
ドキシサイクリンで 7 日間誘導した後の誘導性 Cas9 ベクターのゲノム編集活性
構成型（CAG-Cas9）または誘導型（TRE3G-Cas9）Cas9発現レンチウイルス粒子を MOI = 0.3で細胞に形質導入し、10 µg/mLのブラスチシジンを使用してテトラサイクリンを含まない培地で10日間選択しました。次に、Cas9安定細胞にDNMT3BまたPPIB-sgRNA レンチウイルス粒子をMOI = 0.3で形質導入しました。テトラサイクリンを含まない培地で、細胞を 2 μg/mLピューロマイシンで2日間選択培養し、2つの集団（DOX-：非誘導、DOX+：誘導）に分割してドキシサイクリンでさらに 7 日間培養しました。次に細胞を溶解し、T7EIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイを用いてIndelについて分析しました。
誘導型Cas9ヌクレアーゼベクターは、ドキシサイクリン誘導なしで21日後に最小限のリークを示す
構成型（CAG-Cas9）または誘導型（TRE3G-Cas9）Cas9発現レンチウイルス粒子を MOI = 0.3で細胞に形質導入し、10 µg/mLのブラスチシジンを使用してテトラサイクリンを含まない培地で10日間選択しました。次に、Cas9安定細胞にDNMT3または PPIB-sgRNAレンチウイルス粒子をMOI = 0.3で形質導入しました。細胞を2 µg/mLピューロマイシンで選択し、テトラサイクリンを含まない培地で21日間維持しました。次に細胞を溶解し、T7EIを用いたDNAミスマッチ検出アッセイを用いてIndelについて分析しました。
誘導型U2OS-Cas9細胞におけるドキシサイクリンの用量反応
細胞に誘導型（TRE3G-Cas9）Cas9発現レンチウイルス粒子をMOI = 0.3で形質導入し、テトラサイクリンを含まない培地中で10 µg/mLのブラストサイジンを使用して 10日間選択しました。次に、Cas9安定細胞にMOI = 0.3でPPIB-sgRNAレンチウイルス粒子を形質導入しました。細胞を2 µg/mLのピューロマイシン・テトラサイクリン不含培地で4日間選択し、トリプシンで懸濁し、様々な濃度のドキシサイクリン（0～1000 ng/mL）含有の培地の96ウェルプレートに播種しました。細胞を 72時間インキュベートし、溶解し、T7EIによるDNAミスマッチ検出アッセイを使用してIndel形成について分析しました。
上のパネル：PPIBターゲットアンプリコンのT7EIを使用したDNAミスマッチ検出アッセイの代表的なゲル画像
下のパネル：3つの独立して処理されたウェルからの遺伝子編集の推定パーセンテージの平均±SD
Lentiviral Cas9 ヌクレアーゼデータ
異なるプロモーターによる Cas9 の発現差により、さまざまなレベルのゲノム編集が誘導される
（A）ヒト組換えU2OSユビキチン-EGFPプロテアソーム細胞株（Ubi[G76V]-EGFP）と（B）マウス線維芽細胞（NIH/3T3）に、図示のプロモーターで駆動するCas9とブラストサイジン耐性遺伝子を含むレンチウイルス粒子を安定的に形質導入しました。安定して組み込まれたCas9-blastRを有する細胞集団は、トランスフェクションの前に最低10日間ブラストサイジンで選択されました。DharmaFECT 1およびDharmaFECT 3トランスフェクション試薬をそれぞれ使用して、ヒトPPIB/マウスPpibを標的とする50 nM化学合成crRNA:tracrRNAを細胞にトランスフェクトしました。72 時間後、遺伝子編集の相対頻度は、トランスフェクトされた細胞から抽出されたゲノムDNAでT7EIを使用するDNAミスマッチ検出アッセイに基づいて計算しました。