Cas9ヌクレアーゼ発現試薬
プロモーターおよび濃縮方法を選択できる非レンチウイルスCas9発現プラスミド
Edit-R 化学合成ガイドRNAと直接共トランスフェクションするための、エンドトキシンフリーの精製済みDNAです。Cas9発現細胞の濃縮を簡便にする3つのオプションをご用意しています。
特長
CRISPR-Cas9システムにおけるCas9ヌクレアーゼ
CRISPR関連酵素Cas9は、ゲノムDNAの標的認識とDNA二重鎖切断（DSB）のためにガイドRNAを必要とするRNA-guidedエンドヌクレアーゼです。
Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドは、RNA pol IIプロモーターの制御下にあるS. pyogenes Cas9遺伝子のヒトコドン最適化バージョンをコードします。Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドは、Edit-R 化学合成ガイドRNAと直接共トランスフェクションするためのエンドトキシンフリーの精製済みDNAとして提供される非レンチウイルスベクターです。
Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドのハイライト
- 使用する濃縮方法と細胞タイプに基づいて、3つのプラスミドオプションから選択できます。
-
- mKate2蛍光レポーター
- ピューロマイシン耐性マーカー
- hCMVプロモーターおよびブラストサイジン耐性マーカー
- 6つのSMARTchoiceプロモーターオプションから選択できます。
すべてのRNA pol IIプロモーターは異なる細胞環境で同等にアクティブではない
Cas9ヌクレアーゼの転写を制御する任意のプロモーターの活性は、生物学的状況によって大きく異なる可能性があり、Cas9の発現レベルが変化し、ひいてはDNA切断のレベルが変化します。したがって、細胞株または細胞タイプに最適なプロモーターを選択することは、実験におけるゲノム編集の程度に影響します。Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドには、6つの異なるよく特徴付けられた細胞プロモーターが用意されており、その中から選択できます。実験に最適なプロモーターの決定については、SMARTchoice promoter selection plateを参照してください。
Cas9ヌクレアーゼを発現するための6つのSMARTchoiceプロモーターオプション
| Promoter | Description |
|---|---|
| hCMV | human cytomegalovirus immediate early promoter |
| mCMV | mouse cytomegalovirus immediate early promoter |
| hEF1α | human elongation factor 1 alpha promoter |
| mEF1α | mouse elongation factor 1 alpha promoter |
| PGK | mouse phosphoglycerate kinase promoter |
| CAG | chicken beta actin hybrid promoter |
製品情報
| 製品 | 製品タイプ | プロモーター | Size |
|---|---|---|---|
|
Cas9 Expression Plasmid |
mKate2 蛍光マーカー搭載タイプ |
hCMV, mCMV, hEF1α, mEF1α, PGK, CAG |
120 µg |
| Puromycin 耐性遺伝子搭載タイプ | 120 µg | ||
|
CRISPR-Cas9 Nuclease Expression Plasmid |
Blasticidin 耐性遺伝子搭載タイプ | hCMV | 120 µg |
Cas9-mKate2発現プラスミドのベクターエレメントとプロモーターオプション
Cas9-mKate2 プラスミドは、単量体赤色蛍光タンパク質mKate2、および6種類のRNA pol II プロモーターのいずれかによって駆動されるS. pyogenes由来のヒトコドン最適化Cas9ヌクレアーゼを発現します。自己切断ペプチドT2Aを使用してmKate2の発現をCas9ヌクレアーゼにリンクすることにより、FACSによるmKate2陽性細胞のソーティングによりCas9発現細胞が濃縮され、ゲノム編集イベントを受けた細胞のパーセンテージが増加します。
Cas9-PuroR発現プラスミドのベクターエレメントとプロモーターオプション
Cas9-PuroRプラスミドは、ピューロマイシン耐性選択マーカー、および6種類のRNA pol II プロモーターのいずれかによって駆動されるS. pyogenes由来のヒトコドン最適化Cas9ヌクレアーゼを発現します。自己切断ペプチドT2Aを使用してピューロマイシン耐性マーカーの発現をCas9ヌクレアーゼにリンクすることにより、ピューロマイシンで処理して細胞を選択すると、Cas9発現細胞が濃縮され、ゲノム編集イベントを受けた細胞のパーセンテージが増加します。
ワークフロー
Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドとEdit-R 化学合成ガイドRNAを使用した遺伝子ノックアウトワークフロー
ゲノム編集に必要なEdit-R CRISPR-Cas9コンポーネント（Cas9ヌクレアーゼを発現するプラスミド、tracrRNA、目的の標的部に対して設計されたcrRNA）の図:
遺伝子破壊を行うために、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用して、選択した哺乳類細胞に3つのコンポーネントのすべてをコトランスフェクトします。トランスフェクトされた細胞の濃縮は、蛍光細胞選別またはピューロマイシン耐性の選択によって行うことができます。
Less time preparing, more time experimenting
Edit-R Gene Engineeringシステムは、高品質の化学合成tracrRNAとcrRNAを用いてCas9ヌクレアーゼをプログラムするため、個々のsgRNAをクローン化する必要がなく、時間と労力を節約できます。
サポートデータ
SMARTCas9-mKate2発現プラスミドを使用したCas9発現U2OS細胞のFACSによる濃縮は、標的ゲノム編集の増加をもたらす
FACSによるSMARTCas9-mKate2発現プラスミドを使用したCas9発現U2OS細胞の濃縮により、ヒトPPIBの編集%が増加します。U2OS細胞に、SMARTCas9-mKate2（ヒトCMVプロモーターを含む）発現プラスミド、およびヒトPPIB遺伝子を標的とするtracrRNA:crRNAをトランスフェクトしました。72時間後にMoFlo XDP 100機器でmKate2蛍光のnegative、low、high対応する細胞をソーティングし、3つのチューブに分けました。SURVEYOR™ DNAミスマッチアッセイは、選別されたU2OS細胞で実行し、%ゲノム編集が、US（= unsorted）および対照であるUT（= untransfected）と比較しました。編集のレベルは、デンシトメトリー（%編集）を使用して計算しました。ソーティング細胞では、mKate2発現の増加と相関して、%ゲノム編集の増加が観察されます。