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CRISPRi synthetic sgRNA(化学合成sgRNA)

タンパク質をコードするヒト遺伝子の効率的な転写抑制のためのデザイン済みCRISPRi化学合成sgRNA

  • 化学合成sgRNAは、最も迅速なCRISPRiシステムであり、トランスフェクション後24時間以内に抑制を観察可能
  • レンチウイルスフリーのCRISPRiワークフローのためのdCas9-SALL1-SDS3 mRNAとのコトランスフェクトまたはエレクトロポレートが可能
  • プール試薬または個別試薬として利用可能

 

特長

CRISPRiによる効率的な内性遺伝子転写抑制

CRISPR interferenceCRISPRi)は、CRISPR-Cas9遺伝子編集システムを改変したものです。Horizo​​nCRISPRiシステムは、独自の転写リプレッサー(SALL1およびSDS3)に融合された触媒活性が不活性化されたCas9dCas9)を利用します。転写開始部位(TSS)のすぐ下流の遺伝子を標的とするアルゴリズム設計のガイドRNAと組み合わせると、転写抑制が促進されます。

Diagram of CRISPRi-based transcriptional repression

CRISPRi化学合成sgRNA試薬のハイライト
  • 配列デザインの異なる3種類のsgRNA混合物(プールまたは個別の試薬として利用可能で、非常に効果的な転写抑制を提供します(サポートデータ参照)。
  • Horlbeckらによって公開されたアルゴリズムに基づいた設計です。最適化された設計による強力なレベルの遺伝子転写抑制を示しています(参考文献参照)。
  • 化学的に修飾されたsgRNAは、ヌクレアーゼ分解に対する安定性を高め、全体的なパフォーマンスを向上させます。
  • 異なる転写開始部位を持つ遺伝子については、別個のガイドRNAデザインが利用可能です(P2とラベル付けされています)。
化学合成sgRNAを使用したCRISPRi実験に必要な試薬
  • ターゲット遺伝子のCRISPRi化学合成sgRNA
  • CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子またはmRNA(ワークフロー参照)

製品情報

CRISPRi synthetic sgRNA (化学合成sgRNA)

配列デザインの異なる3種類のsgRNAを混合して1本のチューブにまとめたpoolフォーマット、3種類のsgRNAを3本のチューブに個別に入れてセットとしたSet of 3フォーマット、3種類のsgRNAを個別としたindividual フォーマットをご用意しています。

    製品 生物種 Size
    CRISPRmod Human CRISPRi Individual sgRNA Human 2, 5, 10 nmol
    CRISPRmod Human CRISPRi Set of 3 sgRNA 2, 5, 10 nmol x 3
    CRISPRmod Human CRISPRi sgRNA pool 2, 5, 10 nmol

    CRISPRi 化学合成sgRNA用コントロール

    CRISPRi化学合成sgRNAポジティブコントロール

    遺伝子転写抑制のための最適な実験条件の評価のためのプールされたまたは個々のsgRNAコントロール

    CRISPRi化学合成sgRNA非ターゲティングコントロール

    遺伝子標的特異的sgRNAの非存在下でCRISPRiコンポーネントに対するベースライン細胞応答を評価するためのnon-targetingコントロール

    製品 生物種 Size
    ポジティブコントロールSynthetic sgRNA    
    CRISPRmod SEL1L CRISPRi sgRNA control Human 2, 5 nmol
    CRISPRmod SEL1L CRISPRi sgRNA control pool
    CRISPRmod PPIB1 CRISPRi sgRNA control
    CRISPRmod PPIB1 CRISPRi sgRNA control pool
    ネガティブコントロールSynthetic sgRNA    
    CRISPRmod CRISPRi sgRNA Non-targeting control #1~5 2, 5 nmol

    CRISPRi化学合成sgRNA Cherry-Pickライブラリー

    Cherry-Pick library toolを用いて、お客様が選択した遺伝子に対するデザイン済みCRISPRi 化学合成 sgRNAを、96あるいは384ウェルプレートに分注してお届けするサービスです。

    • ご希望のウェルにコントロールを追加できます。
    • Poolフォーマットと、Individualフォーマットがあります。Individualフォーマットは1遺伝子につき1~3配列から選択できます。
    • 最低注文数:20ウェル分の製品(96ウェルプレートの場合)、40ウェル分の製品(384ウェルプレートの場合)

     

    製品 生物種 Size
    CRISPRmod Human CRISPRi sgRNA pool
    (3配列の混合物/ウェル)
    Human 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 nmol(1 poolあたり)
    CRISPRmod Human CRISPRi Individual sgRNA

    (1配列/ウェル)

    0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 nmol(1 配列あたり)

    ワークフロー

    CRISPRi製品は、特定の実験ニーズをサポートするために、以下のいくつかの方法で組み合わせることができます。1)化学合成sgRNAとdCas9-SALL1-SDS3 mRNAの同時トランスフェクション、2)CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子を使用して安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞株を作成し、化学合成sgRNAを導入する、または3 )安定した細胞株を作成し、プラスミドまたはレンチウイルスsgRNAのいずれかを導入する。

    化学合成sgRNAdCas9-SALL1-SDS3mRNAを使用したCRISPRiワークフロー

    CRISPRi workflow with dCas9-SALL1-SDS3 mRNA and synthetic sgRNA

    細胞をCRISPRi合成sgRNAおよびCRISPRidCas9-SALL1-SDS3mRNAでコトランスフェクトまたはエレクトロポレートします。次に、蛍光またはピューロマイシン耐性オプションを使用して細胞集団を濃縮します。このシステムは、迅速で一過性の遺伝子転写抑制研究に最適です。


    化学合成sgRNAdCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子を使用したCRISPRiワークフロー

    CRISPR interference workflow with lentiviral dCas9-SALL1-SDS3 and synthetic sgRNA

    dCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子で細胞を形質導入して、CRISPRi実験向けの安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞を作製します。次に、ターゲット遺伝子に特異的なCRISPRi化学合成sgRNAを導入します。このシステムは、トランスフェクション可能な細胞モデルでのアレイ化スクリーニングに最適です。

    サポートデータ

    CRISPRi遺伝子転写抑制はトランスフェクションの24時間後に観察され、トランスフェクションの48〜72時間後に最大になる

    CRISPRi gene repression is observed 24 hours post-transfection and is maximal 48-72 hours post transfection

    CRISPRi化学合成sgRNAは、dCas9-KRABおよびdCas9-SALL1-SDS3発現細胞の両方で、トランスフェクション後4872時間で最大の抑制を達成します。dCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS細胞を、10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、CBX1HBP1、またはSEL1Lをターゲットとするデザイン済み化学合成sgRNA25nM)のプールでトランスフェクトしました。トランスフェクションの24487296120、および144時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDH用いた∆∆ Cq法で計算non-targetingコントロール(NTC)に対して正規化ました。


    CRISPRi化学合成sgRNAによる遺伝子ノックダウンの促進

    Pooling synthetic sgRNA enhances CRISPRi activity

    個別のCRISPRi sgRNAは、独立して強力な標的遺伝子抑制を達成しますが、プールすると、抑制レベルの向上を示します。dCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT4トランスフェクション試薬を使用して、BRCA1PSMD7SEL1L、またはST3GAL4を標的とする化学合成sgRNAトランスフェクトしました。デザイン済みsgRNAは、個別に使用、またはプールフォーマットを使用しました(合計濃度25 nM)。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDH用いた∆∆ Cq法で計算non-targetingコントロール(NTC)に対して正規化ました。


    CRISPRiは内遺伝子の発現レベルに依存しない

    CRISPRi transcriptional repression varies by gene but appears to be independent of endogenous expression levels

    CRISPRiの転写抑制は遺伝子によって異なりますが、内遺伝子の発現レベルに依存しているようには見えません。データは、dCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS細胞において、以下のマッチング条件で実行された複数のトランスフェクションから編集されました。細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して、異なる基礎発現レベルの21個の遺伝子を標的とする化学合成sgRNAプール(25 nM)をトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いた∆∆ Cq法で計算、non-targetingコントロール(NTC)に対して正規化ました。 CRISPRiを介した標的遺伝子の抑制は、左のグラフに示されています。ここでは、遺伝子が低レベルから高レベルの基本転写産物発現の順に並べられています。右のグラフでは、ターゲット遺伝子発現が、100万あたりの転写産物のkbあたりのフラグメント(FPKM)に対してプロットされています。これは、親U2OS細胞株からのRNA-Seqデータに基づく基本的な遺伝子発現の表現です。U2OS細胞では、PPIBはSOX2の約100倍の基礎レベルで発現しますが、両方の遺伝子はCRISPRmod CRISPRi試薬を使用して基礎的な発現の約20〜25に抑制できます。


     

    dCas9-SALL1-SDS3発現細胞と化学合成sgRNAによる強力な遺伝子転写抑制

    Robust gene repression with dCas9-SALL1-SDS3 expressing cells and synthetic sgRNA

    dCas9-SALL1-SDS3安定発現細胞における化学合成sgRNAによる強力な遺伝子転写抑制。dCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS、A375、およびA549細胞を、10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECTトランスフェクション試薬を使用して、BRCA1、PSMD7、SEL1L、またはST3GAL4を標的とするプールフォーマットの化学合成sgRNA(25 nM)をトランスフェクトしました。dCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するJurkat細胞、Lonza 96ウェルシャトルシステムを用いて、BRCA1、PSMD7、SEL1L、またはST3GAL4をターゲットとするプールフォーマット化学合成sgRNA(2.5 µM)を導入しました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的な遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いた∆∆Cq法で計算しnon-targetingコントロール(NTC)に対して正規化ました。