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CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNA

dCas9-SALL1-SDS3発現のためのレンチウイルスフリーオプション

標的遺伝子の転写抑制のための化学合成CRISPRi sgRNAとのコトランスフェクションまたはエレクトロポレーションのための精製されたdCas9-SALL1-SDS3mRNA

 

特長

CRISPRiによる効率的な内在性遺伝子転写抑制

CRISPR interferenceCRISPRi)は、CRISPR-Cas9遺伝子編集システムを改変したものです。Horizo​​nCRISPRiシステムは、独自の転写リプレッサー(SALL1およびSDS3)に融合された触媒活性が不活性化されたCas9dCas9)を利用します。転写開始部位(TSS)のすぐ下流の遺伝子を標的とするアルゴリズム設計のガイドRNAと組み合わせると、転写抑制が促進されます。

Diagram of CRISPRi-based transcriptional repression

dCas9-SALL1-SDS3 mRNAは、ヌクレアーゼ非活性化S. pyogenes Cas9遺伝子のヒトコドン最適化バージョンを発現し、独自の転写リプレッサー(SALL1およびSDS3)に融合しています。

dCas9-SALL1-SDS3 mRNAは、EGFPまたはピューロマイシン耐性(PuroR)のいずれかの搭載タイプで入手できます。FACSまたは抗生物質選択を使用したトランスフェクションの最適化または濃縮が可能となります。

dCas9-SALL1-SDS3mRNAのハイライト
  • 化学合成CRISPRiガイドRNAdCas9-SALL1-SDS3 mRNAを簡単にコエレクトロポレートまたはコトランスフェクト(DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用)できます。
  • dCas9-SALL1-SDS3発現細胞株の作製が不要です。
  • 細胞集団の濃縮を可能にする蛍光および抗生物質耐性オプションがあります。
  • mRNAは翻訳の準備ができているので、最適なプロモーター選択の必要はありません。
dCas9-SALL1-SDS3mRNAを使用したCRISPRi実験に必要な試薬
  • CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNA
  • ターゲット遺伝子のCRISPRi化学合成sgRNA(ワークフローを参照)

製品情報

CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNA

    製品 Size
    CRISPRmod dCas9-SALL1-SDS3 mRNA 20 µg, 100 µg, 500 µg
    CRISPRmod EGFP dCas9-SALL1-SDS3 mRNA
    CRISPRmod Puro dCas9-SALL1-SDS3 mRNA

    ワークフロー

    化学合成sgRNAdCas9-SALL1-SDS3mRNAを使用したCRISPRiワークフロー

    CRISPRi workflow with dCas9-SALL1-SDS3 mRNA and synthetic sgRNA

    細胞をCRISPRi合成sgRNAおよびCRISPRidCas9-SALL1-SDS3mRNAでコトランスフェクトまたはエレクトロポレートします。次に、蛍光またはピューロマイシン耐性オプションを使用して細胞集団を濃縮します。このシステムは、迅速で一過性の遺伝子転写抑制研究に最適です。

    サポートデータ

    dCas9-SALL1-SDS3と化学合成sgRNAによる堅牢な一過性の遺伝子抑制

    Robust gene knockdown with CRISPRi synthetic sgRNA positive controls

    dCas9-SALL1-SDS3 mRNAと化学合成sgRNAポジティブコントロールの同時導入による強力な遺伝子転写抑制。 K562およびJurkat細胞に、Lonza 96ウェルシャトルシステムを用いて、dCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3 mRNA2 µg)、および、PPIBあるいはSEL1Lをターゲットとするプールフォーマット化学合成sgRNA5 µM)を導入ました。WTC-11 hiPS細胞に、Lonza 96ウェルシャトルシステムを用いて、dCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3 mRNA1 µg)、および、PPPIBまたはSEL1Lをターゲットとするプールフォーマット化学合成sgRNA3 µM)を導入しました。72時間後に細胞を回収しました。全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的な遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いた∆∆Cq法で計算し、non-targetingコントロール(NTC)に対して正規化しました。


    dCas9-SALL1-SDS3 mRNACRISPRi化学合成sgRNAの同時トランスフェクションは、安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞株へのトランスフェクションよりも大きな遺伝子転写抑制をもたらす

    Co-transfection of dCas9-SALL1-SDS3 mRNA and CRISPRi synthetic sgRNA provides greater gene repression than transfection into a stable dCas9-SALL1-SDS3 expressing cell line

    dCas9-SALL1-SDS3 mRNAと化学合成sgRNAの同時トランスフェクションは、短い時点において、安定した細胞株へのトランスフェクションよりも大きな遺伝子転写抑制を提供します。データは解析タイミングと導入方法を合わせて、複数の実験から編集されたものです。dCas9-SALL1-SDS3を安定発現するU2OS細胞を10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用してSEL1Lを標的とする化学合成sgRNA25 nM)でトランスフェクトし、親U2OS細胞は、10,000細胞/ウェルでプレーティングし、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用して、dCas9-SALL1-SDS3 mRNA200 ng)およびSEL1Lを標的とする化学合成sgRNA25 nM)をコトランスフェクトしました。dCas9-SALL1-SDS3を安定発現するJurkat細胞に、SEL1Lを標的とする化学合成sgRNA5 µM)を導入し、親Jurkats細胞にはdCas9-SALL1-SDS3 mRNA2 µg)およびSEL1Lを標的とする化学合成sgRNA5 µM)をLonza 96ウェルシャトルシステムを用いて導入しました。dCas9-SALL1-SDS3を安定発現するWTC-11ヒトiPS細胞にSEL1Lを標的とする化学合成sgRNA3 µM)を導入し、親のWTC-11hiPS細胞には、dCas9-SALL1-SDS3 mRNA1 µg)およびSEL1Lを標的とする化学合成sgRNA3 µM)をLonza 96ウェルシャトルシステムを用いて導入しました。U2OS細胞はトランスフェクションの48時間後に回収し、JurkatおよびhiPS細胞は導入72時間後に回収しました。全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。SEL1Lの相対的な遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHまたはACTBを用いたΔΔCq法で計算し、non-targetingコントロール(NTC)に対して正規化しました。


     

    PuroRを共発現するdCas9-SALL1-SDS3mRNAは、ピューロマイシン選択を使用した濃縮を可能にする

    dCas9-SALL1-SDS3 mRNA co-expressing PuroR allows for enrichment using puromycin selection

    K562細胞に、Lonza 96ウェルシャトルシステムを用いて、Puro dCas9-SALL1-SDS3 mRNA2 µg)および、PPIBCD46PSMD7あるいはSEL1LをターゲットとするプールフォーマットのCRISPRmod CRISPRi sgRNAを導入しました。導入24時間後に、2 µg /mlのピューロマイシンを含む増殖培地を細胞に添加し、複製プレートに通常の増殖培地を投与しました。ヌクレオフェクションの48時間後に全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いたΔΔCq法で計算し、non-targetingNTC)に対して正規化しました。


    EGFPを共発現するdCas9-SALL1-SDS3mRNAにより、FACSの濃縮が可能

    dCas9-SALL1-SDS3 mRNA co-expressing EGFP allows for FACS enrichment

    HCT-116細胞を透明な6ウェルプレートに400,000細胞/ウェルで播種しました。 24時間後、DharmaFECT Duoトランスフェクション試薬を使用して、細胞にEGFP-dCas9-KRABまたはEGFP dCas9-SALL1-SDS3 mRNA(2.5 µg)、および、PPIB、PSMD7、またはSEL1L(25 nM)をターゲットとするプールフォーマットのCRISPRmod CRISPRi sgRNAをコトランスフェクトしました。トランスフェクションの24時間後に細胞をトリプシン処理し、FACSで細胞をGFP陰性(GFP Neg)と上位10%GFP発現(上位10%)の2つのカテゴリーに分類しました。選別後、細胞を6ウェルディッシュに再播種し、回復培養しました。回復培養の24時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各標的遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いたΔΔCq法で計算し、non-targetingコントロール(NTC)に対して正規化しました。