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ホーム製品 / サービス情報CRISPR ModulationCRISPRi 遺伝子転写抑制

CRISPRi(CRISPR interference)遺伝子転写抑制

CRISPRi遺伝子転写抑制により、研究者はDNAを編集することなく、転写をブロックすることによって特定の遺伝子機能をダウンレギュレートすることができます。

このシステムを動作させるには、遺伝子特異的なガイドRNAと転写抑制ドメイン(SALL1およびSDS3)に融合し触媒活性が不活化されたCas9dCas9)の2つのコンポーネントが必要です。

デザイン済み CRISPRi ガイドRNA

アルゴリズムで設計されたレンチウイルスベクターおよび化学合成シングルガイドRNAsgRNA)は、遺伝子の転写開始部位(TSS)のすぐ下流を特異的に標的とします。

  • CRISPRi synthetic sgRNA(化学合成sgRNA)
  • トランスフェクション後24時間以内に抑制される最も迅速なCRISPRiシステムです。化学合成RNAはヌクレアーゼ分解に対する耐性のために修飾されており、プールフォーマットまたは個別の試薬として利用できます。
  • CRISPRi lentiviral sgRNA(レンチウイルスsgRNA)

    トランスフェクションが困難な細胞、または長期間の抑制が必要な場合のCRISPRiの理想的なデリバリー方法です。

 

CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3

独自の転写リプレッサードメインSALL1およびSDS3に融合したヌクレアーゼを不活化したCas9です。

 

CRISPRiとは?

CRISPR interference(CRISPRi)は、特異性の高い遺伝子ノックダウンの新しい手法です。遺伝子切断を伴わないCRISPRシステムです。

Horizo​​nのCRISPRiシステムは、独自のSALL1-SDS3リプレッサーコンストラクトに融合した不活化Cas9ヌクレアーゼ(dCas9)を使用して、DNAを切断せずに標的遺伝子の転写をブロックします。

CRISPRiの利点:
  • CRISPRレベルの特異性:PAMアンカー型ターゲティングシステム
  • 遺伝子機能の抑制:遺伝子をノックアウトではなくノックダウンします。
  • 長い時系列変化を観察可能:siRNAより長い抑制期間
  • 遺伝子のネイティブコンテキスト内でのダウンレギュレーション
理想的なアプリケーション:
  • 機能喪失:生物学的に関連するノックダウンモデルでの遺伝子機能研究
  • マルチプレックス:複数の遺伝子の同時ノックダウンに最適
  • 直交検証:堅牢なデータのためにCRISPRノックアウトまたはRNAiと並行しての使用

 

ポスター:CRISPRi research

日本語版をアプリケーションノート形式でご説明しています。

 

CRISPRiシステム

Horizon のCRISPRiシステムには、リプレッサータンパク質(SALL1およびSDS3)に融合した特殊なdCas9と、遺伝子の転写開始部位(TSS:transcriptional start site)のすぐ下流の領域をターゲットとするように設計されたガイドRNAの2つのコンポーネントが必要です。ガイドRNAはdCas9-SALL1-SDS3と複合体を形成し、その複合体をDNAの標的部位に誘導します(図)。

Horizonは、dCas9-リプレッサータンパク質とガイドRNAの細胞への導入の双方に、レンチウイルスによる長期発現および一過性発現のアプローチを提供します。

horizon discovery image

遺伝子の転写開始部位(TSS)のすぐ下流の領域を標的とするsgRNAと複合体を形成したdCas9-SALL1-SDS3の図解。CRISPRiシステムでは、dCas9-SALL1-SDS3タンパク質とCRISPRiガイドRNAの2つのコンポーネントを目的の細胞に導入する必要があります。

 

dCas9-SALL1-SDS3リプレッサーコンストラクト

ネイティブのCas9のDNA切断機能を点突然変異によって消滅させ、その不活化されたCas9(dCas9)タンパク質にHorizon独自のSALL1およびSDS3リプレッサードメインを融合することにより、遺伝子抑制に用いることができるようになりました。

Horizo​​n Discoveryは、dCas9-SALL1-SDS3コンストラクトを作製する前に、多くのリプレッサーコンストラクトをテストしました。現在の多くのCRISPRiシステムはdCas9-KRABバリアント(Gilbert et al. 2013, Yeo et al. 2018, Moghadam et al. 2020, Alerasool et al. 2020)に依存していますが、dCas9タンパク質に共有結合したHorizonの新しいリプレッサーは、クロマチンリモデリングと遺伝子サイレンシングに関与するタンパク質を動員することにより、標的遺伝子の転写をさらに阻害します(Alland et al.2002)。その結果、広く機能するリプレッサーが得られ、遺伝子発現は低下しますが、完全消滅にはなりません。

CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3は、一過性発現用のmRNAとして、または安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞株を作製するためのレンチウイルス粒子として利用できます。

 

CRISPRi ガイドRNA

すべてのHorizonのガイドRNAは、特異性とパフォーマンスを最大化するようにアルゴリズムが最適化されており、化学合成およびレンチウイルスパッケージフォーマットの両方で利用できます。

CRISPRiは、転写抑制を引き起こすために、標的遺伝子の転写開始部位(TSS:transcriptional start site)の下流の0〜300塩基対の領域を標的とするガイドRNAのデザインを必要とします。TSSは、いつも十分にアノテーションされているわけではなく、また、他のタンパク質因子のためにアクセスできないことがあるため、機能的なガイドRNAの設計が困難な場合があります。HorizonのCRISPRiガイドRNA製品は、機械学習技術を用いて開発されたCRISPRi v2.1アルゴリズム(MA Horlbeck et al., 2016)を使用しています。このアルゴリズムは、FANTOMおよびEnsemblデータベースを使用してTSSを予測し、クロマチン、位置、および配列データを組み込んで、非常に効果的なガイドRNAの設計を予測しました。別個のTSSを持つ遺伝子については、それぞれのTSSを標的とするガイドRNAが提供されています。Horizo​​nは、TSSごとに3つのガイドRNAデザインを、予測される機能の順にランク付けしてリストしています。

 

試薬選択のためのCRISPRiアッセイの考慮事項

CRISPRiの実験条件には多くのオプションと考慮事項があります。一般的には、dCas9-SALL1-SDS3が安定発現した細胞集団で作業するときに最も強力なノックダウンを達成します。長時間のアッセイ(120時間以上)では、多くの人がレンチウイルスベクターsgRNAを選択します。短期間のアッセイ(120時間未満)の場合、化学合成sgRNAは、ガイドRNA発現ベクターよりも強力な遺伝子発現抑制を提供します。

CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3ソース ガイドRNAフォーマット デリバリー方法 メリットと推奨される使い方
CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子

CRISPRi dCas9安定発現細胞のための形質導入と選択

CRISPRi化学合成sgRNA トランスフェクション

または

エレクトロポレーション

  • 期間のアッセイ
  • 標的遺伝子機能の抑制を高めるためのプール化ガイドRNAの使用
  • 遺伝子経路またはネットワーク内での複数遺伝子の同時ノックダウン
  • アレイ化スクリーニング
CRISPRiレンチウイルスsgRNA粒子 形質導入
  • 比較的長い期間のアッセイのための安定的な発現
  • 低MOI:ゲノム当たり1コピーの導入により、安定的に抑制を実現
CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNA CRISPRi 化学合成sgRNA コトランスフェクション

または

エレクトロポレーション

  • 短時間のアッセイ:数時間以内に解析できる実験
  • レンチウイルスフリーのワークフロー
  • EGFPおよびピューロマイシン耐性遺伝子をマーカーとした、dCas9-SALL1-SDS3発現細胞の濃縮
  • 標的遺伝子の転写抑制を高めるためのプール化ガイドRNA
  • 遺伝子経路またはネットワーク内での複数遺伝子の同時ノックダウン
  • 初代培養細胞での実験に最適

ワークフロー

CRISPRi製品は、特定の実験ニーズをサポートするために、以下のいくつかの方法で組み合わせることができます。1)化学合成sgRNAdCas9-SALL1-SDS3 mRNAの同時トランスフェクション、2CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子を使用して安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞株を作製し、化学合成sgRNAを導入する、または3 )安定した細胞株を作製し、プラスミドまたはレンチウイルスsgRNAのいずれかを導入する。

化学合成sgRNAdCas9-SALL1-SDS3mRNAを使用したCRISPRiワークフロー

CRISPRi workflow with dCas9-SALL1-SDS3 mRNA and synthetic sgRNA

細胞をCRISPRi化学合成sgRNAおよびCRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNAでコトランスフェクトまたはエレクトロポレートします。次に、蛍光またはピューロマイシン耐性オプションを使用して細胞集団を濃縮します。このシステムは、迅速で一過性の遺伝子転写抑制研究に最適です。


化学合成sgRNAdCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子を使用したCRISPRiワークフロー

CRISPR interference workflow with lentiviral dCas9-SALL1-SDS3 and synthetic sgRNA

dCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子で細胞を形質導入して、CRISPRi実験向けの安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞を作製します。次に、ターゲット遺伝子に特異的なCRISPRi化学合成sgRNAを導入します。このシステムは、トランスフェクション可能な細胞モデルでのアレイ化スクリーニングに最適です。

 


レンチウイルスsgRNAdCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子を使用したCRISPRiワークフロー
CRISPRi workflow using lentiviral dCas9-SALL1-SDS3 and expressed sgRNA

CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3レンチウイルス粒子を使用して安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞株を確立し、CRISPRiレンチウイルスsgRNA粒子(左)またはプラスミドsgRNA(右)を導入するワークフローです。このシステムは、トランスフェクションが難しいタイプの細胞を扱う場合に理想的です。

サポートデータ

複数の遺伝子の同時ノックダウン

CRISPRi化学合成sgRNAは、複数の遺伝子を同時にノックダウンするための独自の方法を提供します。各ガイドRNAは、その特定のDNAターゲットに独立して結合し、外から供給されるdCas9融合タンパク質に依存するため、内在性経路の競合を最小限に抑えます。

化学合成sgRNAの混合物の使用により、遺伝子転写抑制を強化したり、ヒトiPS細胞の複数の遺伝子を同時にノックダウンしたりすることができます

個々のCRISPRi用 sgRNAを混合して単一の試薬にしたプールを用いて、ターゲット遺伝子の転写抑制を強化したり、多重化して複数の遺伝子の同時転写抑制を可能にしたりすることができます。dCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するWTC-11ヒトiPS細胞に、Lonza 96ウェルシャトルシステムを用いて、PPIB・SEL1LおよびRAB11Aを標的とする化学合成sgRNAを導入しました。各遺伝子ターゲットに対して最も有効なデザイン済みsgRNAを選択し、個別に、またはガイドRNAあたり3μMの濃度でマルチターゲットプール(3つの異なる遺伝子をターゲットとするsgRNAの混合物)の一部として使用しました。ヌクレオフェクションの72時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各ターゲット遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてACTBを用いたΔΔCq法で計算し、non-targeting control(NTC)に対して正規化しました。 3つの遺伝子は、発現抑制の程度が大幅に減少したり、細胞の生存率と形態が著しく変化したりすることなく、同時に発現抑制されました。

 

長い時系列変化を観察可能

Horizonは、CRISPRi化学合成シングルガイドRNA(sgRNA)を最初に提供したことを誇らしく思います。このフォーマットは、CRISPRi dCas9-SALL1-SDS3 mRNAとのコトランスフェクションまたはエレクトロポレーション、または安定したdCas9-SALL1-SDS3発現細胞への導入を可能にし、いずれかの方法によりCRISPRi結果を取得するための最速の方法を選べます。この方法では、遺伝子抑制はトランスフェクションの24時間後には認められ、96時間まで持続します。

dCas9-SALL1-SDS3と化学合成sgRNAによる強力な転写抑制

dCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3を安定して発現するU2OS細胞に、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して化学合成sgRNAの混合物(25 nM)をトランスフェクトしました。トランスフェクションの24、48、72、96、120、および144時間後に細胞を回収し、全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。各ターゲット遺伝子の相対的発現は、ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いたΔΔCq法で計算し、non-targeting control(NTC)に対して正規化しました。 dCas9-SALL1-SDS3は、dCas9-KRABよりも、すべての時点および遺伝子ターゲットにわたって一貫して強い転写抑制を実現しました。

 

dCas9-KRABを使用したCRISPRiよりも強力なタンパク質レベルの抑制

蛍光抗体分析によるタンパク質レベルのノックダウン

TFRC遺伝子の機能的ノックダウンを、hEF1αプロモーターの制御下でdCas9-KRABまたはdCas9-SALL1-SDS3のいずれかを構成的に発現するU2OS細胞を用いて評価しました。TFRCを標的とする3つのsgRNAを含むsgRNA混合物(25 nM)を、DharmaFECT 4トランスフェクション試薬を使用して細胞にトランスフェクトしました。トランスフェクションの72時間後に細胞を分割し、トランスフェクションの96時間後に細胞を固定し、TFRCを標的とする一次抗体とAlexa Fluor488標識蛍光二次抗体で染色しました。ヘキスト染色を使用して核を同定しました。複製プレートからRNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。 dCas9-SALL1-SDS3を用いた場合、mRNAレベルとタンパク質レベルの両方でターゲット遺伝子のより強いノックダウンを実現できることが示されました。

トランスフェクションが困難な細胞モデルにおけるCRISPRi遺伝子ノックダウン

dCas9-SALL1-SDS3 mRNAと化学合成sgRNAの同時導入によるCRISPRi遺伝子転写抑制

dCas9-SALL1-SDS3 mRNAは、複雑な細胞モデルにおいてCRISPRによる迅速な遺伝子転写抑制を可能にします。遺伝子転写抑制の強化は、EGFPまたはピューロマイシン耐性マーカーのいずれかを共発現するdCas9-SALL1-SDS3 mRNA試薬を使用して達成できます。Lonza 96ウェルシャトルシステムを用いて、dCas9-KRAB mRNAまたはdCas9-SALL1-SDS3 mRNA(2μg)とともに、化学合成sgRNAの混合物(5μM)をK562およびJurkat細胞に導入しました。K562細胞はヌクレオフェクションの48時間後に、Jurkat細胞はヌクレオフェクションの72時間後に回収しました。全RNAを単離し、RT-qPCRを使用して相対的な遺伝子発現を測定しました。

 

参考文献

  1. L.A. Gilbert, et al., CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154(2): p. 442-51 (2013).
  2. NC. Yeo, et al., An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation. Nat Methods. 15(8): p. 611-616 (2018).
  3. F. Moghadam, et al., Synthetic immunomodulation with a CRISPR super-repressor in vivo. Nat Cell Biol. 22(9): p. 1143-1154 (2020).
  4. N. Alerasool, et al., An efficient KRAB domain for CRISPRi applications in human cells. Nat Methods. 17(11): p. 1093-1096 (2020).
  5. L. Alland, et al., Identification of mammalian Sds3, an integral component of the Sin3? Histone deacetylase corepressor complex. Mol and cell bio. 22(8): p.2743-2750 (2002).
  6. M. A. Horlbeck et al., Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760 (2016).

関連リンク

【本社サイト】CRISPRi for transcriptional repression