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カスタムRNA合成 – 化学修飾によるユニークなRNAiアプリケーション

RNA合成

細胞内では、RNAは細胞内酵素によるDNAの転写によって作られます。RNAは、T7 RNAポリメラーゼなどの酵素によってin vitroで作成することもできます。RNAを作るためのもう1つのオプションは、化学合成です。化学合成は、先の2つとは異なり、RNAを作るために酵素を使用しません。代わりに、化学合成は、一度に1つのRNA塩基を追加繰り返しのサイクルで合成します。このようにして、正確に定義された配列と長さの短い一本鎖RNA分子またはRNAオリゴヌクレオチドが作られます。

2′-ACEについて

1995年以来、Dharmaconは、特許を取得した非常に高度な新しいRNA合成化学の開発を通じて、RNA合成技術のリーダーです。このケミストリは、silyl etherが5′-hydroxylを保護し,酸により不安定化するorthoesterが2′-hydroxylを保護するという、新しい保護基スキームに基づいています。[1, 2]。この保護基の化学名は2′-bis(acetoxyethoxy)-methyl etherですが、一般に“2′-ACE”と呼びます。詳細については、特許取得済みのRNA合成化学について詳しく説明している2′-ACE RNA synthesis chemistryテクニカルノートをお読みください。

2′-ACE RNA synthesis chemistryテクニカルノート

2′-ACEの利点

2′-ACEテクノロジーの革新的な特性により、siRNAを高収率で優れた品質で日常的に合成することができます。これは、2′-ACEホスホルアミダイトが高いカップリング効率を可能にし、高品質のRNAとsiRNAを生成できるからです。この合成技術の純度レベルは、通常、未修飾のsiRNAでは80〜85%であり、他の方法(2′-tert-Butyldimethylsilyl ether、TBDMSなど)よりも日常的に高くなっています。2′-ACE保護基の他の利点は、水溶性、ヌクレアーゼ耐性、強力な二次構造の合成、および穏やかで高速で最小限の取り扱いで済む最終的な酸脱保護です。

利用可能なすべてのカスタムオプションと価格の詳細は、本社Websiteをご参照ください。ご希望のRNA合成に基づきフィルターを選択してご利用ください。価格は米国における価格です。日本における価格はオンラインまたはリクエストによりお見積りの上ご確認ください。

利用可能なすべてのカスタムオプションと価格

siRNAの化学修飾の利点

siRNAの化学合成により、配列にさまざまな修飾を位置特異的に組み込むことができます。これらの修飾により、さまざまな実験アプリケーションでsiRNAのパフォーマンスが向上します[3, 4]。

安定性:ヌクレアーゼ分解に対する耐性

siRNAのヌクレアーゼ耐性を高める最も簡単なアプローチは、ヌクレオチド間リン酸結合を直接修飾することです。非架橋酸素を硫黄(PS:phosphorothioate)で置き換えることは、siRNAのヌクレアーゼ耐性を改善するために広く使用されてきました[5]。

リボースの2’位の修飾は、二本鎖の安定性(Tm)を高めながら、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を間接的に改善することができます。この変更は、免疫活性化からの保護を提供することも示されています。

中程度のPSバックボーン修飾と小さくて忍容性の高い2′-置換(2′-O-Methyl、2′-Fluoro、2′-Hydro)の組み合わせにより、in vivoでのアプリケーション向けに非常に安定したsiRNAが作成されることがよくあります[6]。

効力:適切な一時的なサイレンシング期間

siRNAノックダウンが一時的であるのは、主に、細胞分裂と核酸分解による細胞内siRNAの継続的な希釈によるものです。化学修飾の導入により、より多くの無傷のsiRNAが細胞に確実に導入され、また安定化し、適切な鎖がRISCに取り込まれるようになります。たとえば、siRNA内の2′-OMe-修飾を使用した細胞培養では、長期のノックダウンが達成されています[7]。

免疫原性:自然免疫反応の誘導の抑制

in vivo siRNAの1つの主要な課題は、自然免疫系の望ましくない活性化です。dsRNAの免疫刺激効果は、主に3つのToll-likeレセプター(TLR3、TLR7、TLR8)と、レチノイン酸誘導タンパク質(RIG-1)[8]、オリゴアデニル酸シンテターゼ(OAS)、dsRNA応答性キナーゼ(PKR)、およびメラノーマ分化関連タンパク質(MDA-5)などのタンパク質によって媒介されます。[9]。

化学修飾の導入によって、これらの免疫刺激性受容体にsiRNAが認識されないようにすると、siRNAの免疫原性が大幅に低下することが示されています。2′-OMe、2′-F、および2′-Hで特定の配列を変更すると、一般にノックダウン活性を維持しながら、TLR7 / TLR8の相互作用を効果的に減らすことができます[10, 11]。2- thiouracil、pseudouracil、5- methylcytosine、5- methyluracil、N6- methyladenosineなどの追加の修飾も、TLR3、TLR7、TLR8によって媒介される免疫効果を最小限に抑えることが示されています[12]。

特異性:オフターゲット効果の防止

siRNAのいずれかの鎖が意図された標的ではない遺伝子の発現を低下させる場合、これは望ましくなく、「オフターゲティング」として知られています。オフターゲティングが発生する可能性がある2つの場合があります。一つが、siRNAガイド鎖が、標的遺伝子に類似した配列を持つ遺伝子からのmRNA転写産物を標的にする場合です。オフターゲティングが発生するもう1つの場合は、siRNAパッセンジャー鎖がRISCに取り込まれ、パッセンジャー鎖に相補的な配列を持つmRNAターゲットを分解してしまうことです。これらのオフターゲティングメカニズムは両方とも、通常、シード領域での高度な配列類似性、および残りのsiRNAオリゴヌクレオチド全体での不完全な一致によって発生します。このため、これらのオフターゲティングイベントは本質的にmicroRNAに似ていると考えられています[13]。

いずれかのsiRNA鎖がmiRNAのようなオフターゲティングを防ぐために、位置特異的な修飾が​​用いられます。

  • siRNAガイド鎖のシード領域の修飾:オフターゲティングの可能性を減らすために使用されます。
  • 二本鎖への化学修飾の導入:シードTm値が低くなることにより、siRNA効率への悪影響を最小限に抑えながらオフターゲット効果を排除できる可能性があります[14]。
  • 化学修飾:ガイド鎖のロードにバイアスをかけるように二本鎖の熱力学的非対称性を変更することにより、パッセンジャー鎖のRISCへの取り込みを防止することもできます。たとえば、パッセンジャー鎖の5’末端での単一のロック解除された核酸(UNA)修飾は、siRNAガイド鎖のローディングを妨げることなくRISCへの取り込みを減らすことができます[15]。
  • 多くの修飾ヌクレオチド塩基5-bromo、5-iodo、2-thio、4-thio、dihydro-、およびpseudo-uracil):これらも、塩基対形成を安定化し、塩基対形成の特異性を高めるために使用されています[16, 17]。
デリバリー:細胞への取り込み

化学修飾は、特定の細胞や動物へのsiRNAの導入に関連する問題のいくつかを解決するのに役立ちます。RNAとその類似体の負に帯電したリン酸骨格、および細胞膜を構成する脂質二重層の非極性の性質により、siRNAの細胞への導入には困難な場合があります。siRNAの浸透移行性の導入では、さまざまな修飾がsiRNAの細胞への導入を助けることが示されています。これらの修飾には次のものが含まれます。

  • コレステロール
  • トコフェロールと葉酸
  • リンカー
  • 脂質
  • ポリマー
  • ペプチド
  • アプタマー

これらの修飾は、浸透移行性の薬剤としてのsiRNAの潜在的な使用を高めることができます[18]。

イメージング:実験性能を監視するためのプローブ

一部のsiRNA実験では、イメージングsiRNAは、導入の有用なコントロールとなり、または実験モデル内の分子の薬物動態(PK)および薬力学(PD)を決定するために役立ちます。

イメージングプローブを使用できる複数の方法は次のとおりです。

  • どの組織がin vivoで導入されたRNA分子を取り込むかを決定するために、18Fまたは64Cu同位体をsiRNAに結合させ、陽電子放出断層撮影(PET)イメージングに使用できます[19, 20]。
  • 111Inまたは99mTcで標識されたsiRNAを使用した単一光子放射型コンピューター断層撮影(SPECT)は、siRNAのPKおよび生体内分布を定義するために適用されています[21, 22]。
  • レポーターシステムからのルシフェラーゼ発現を定量化するために一般的に使用される生物発光イメージングは​​、in vivoでのsiRNAの機能を定量化するためまたはPDにアクセスするための信頼できるアッセイシステムを提供できます[23]。
  • 生物発光とは別に、in vivo蛍光イメージングでは、哺乳類細胞を介して近赤外線(NIR)色素の存在を検出できます。蛍光は、Cy5またはCy5.5で標識されたsiRNAの生体内分布パターンを研究するために使用されてきました[24, 25]。
サマリー

ご要望のCustom siRNAの設計で使用するのに最適な修飾は、使用するアプリケーションによって異なり、siRNAのデザイン、特定の配列、および導入方法によって異なる場合があります。RNA合成における化学修飾は、採用できるRNAiの実験的アプローチを広げることができます。Dharmaconが提供する膨大な数の化学修飾スキームにより、研究能力が大幅に向上します。Custom RNA合成の化学修飾についてご質問がございましたら、テクニカルサポートチームのサイエンティストにご相談ください。

 

オリジナル英文は、こちらからお読みいただけます。

関連リンク

カスタムRNA合成

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References

  1. Scaringe, S.A. et al. (1998) Novel RNA synthesis method using 5´-silyl-2´-orthoester protecting groups. J. Am. Chem. Soc. 120:11820-11821.
  2. Scaringe, S.A. et al. (2004) Preparation of 5´-silyl-2´-orthoester ribonucleosides for Use in oligoribonucleotide synthesis. Curr. Protoc. Nuc. Acid Chem. 2.10.1-2.10.16.
  3. Rana T.M. (2007) Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs. Nature Reviews Mol. Cell Bio. 8:23-36.
  4. Bramsen, J.B. and Kjems J. (2012) Development of therapeutic-grade small-interfering RNAs by chemical engineering. Frontiers in Genetics 3:1-22.
  5. Kole R. (2012) RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140.
  6. Soutschek, J. et al. (2004) Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432:173-178.
  7. Volkov, A.A. (2009) Selective protection of nuclease-sensitive sites in siRNA prolongs silencing effect. Oligonucleotides 19:191-202.
  8. Hornung, V. et al. (2006) 5’-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-1. Science 314:994-997.
  9. Robbins, M. et al. (2009) siRNA and innate immunity. Oligonucleotide 19:89-101.
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  23. Bartlett D.W. and Davis M.E. (2006) Insights into kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34:322-333.
  24. Huang, Y. et al. (2011) Elimination pathways of systemically delivered siRNA. Mol. Ther. 19:381-385.
  25. Whitehead, K.A. et al. (2014) Degradable lipid nanoparticles with predictable in vivo siRNA delivery activity. Nature Commun. 5:4277.